華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠鎮(zhèn)痛作用機(jī)制的研究

在這個(gè)世界上，癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康。大多數(shù)晚期腫瘤（包括乳腺癌、肺癌、前列腺等）很難檢測，但會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移。超過三分之一的患者會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的骨腫瘤（cibp）。1材料和方法1.1小鼠、鼠之間質(zhì)量關(guān)系、-actin、al-1酶聯(lián)免疫吸附劑篩選出大鼠機(jī)械痛閾值處于26.0～32.0g、熱痛閾值處于14.0～19.0s的SPF級(jí)雌性SD大鼠，體質(zhì)量160～180g，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（鄂）2017-0061。Walker-256乳腺癌細(xì)胞由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理/腫瘤科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室提供，保存于-80℃冰箱中。華蟾素注射液，安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)國藥準(zhǔn)字Z34020274，規(guī)格10mL/支，產(chǎn)品批號(hào)161207-1。小鼠單抗β-actin(42000），武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)BM0627，批號(hào)BST17374212；兔單抗ERK(42000/44000),Cellsignaling公司，貨號(hào)4695，批號(hào)14；兔單抗p-ERK(42000/44000),Cellsignaling公司，貨號(hào)4370，批號(hào)17；兔多抗p-JNK(t183,50000),Abcam公司，貨號(hào)Ab47337，批號(hào)GR297606-4；兔多抗JNK(40000～45000、50000～55000），武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)10023-1-ap，批號(hào)00070315；鼠單抗p-p38(40000),Thermo公司，貨號(hào)Ma5-15218，批號(hào)UE2771694；鼠單抗p38(38000～42000)，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)66234-1-ig，批號(hào)00054597。IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，貨號(hào)E-EL-R0012c，批號(hào)YDVNNNDYDX;MCP-1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，貨號(hào)E-EL-R0633c，批號(hào)NLFBNNDNYR;TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，貨號(hào)E-EL-R0019c，批號(hào)3YJQ4TH51K，均購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ip乳腺癌質(zhì)控取雌性幼鼠（體質(zhì)量60～80g，由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（鄂）2017-0061)ip乳腺癌Walker256細(xì)胞0.5mL（細(xì)胞濃度為4×101.3大鼠左術(shù)后獨(dú)立行為檢測實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、模型組、華蟾素各濃度（低、中、高）組及假手術(shù)+華蟾素（高濃度）組，在造模后第0、2、5、7天進(jìn)行各組大鼠左右后肢行為學(xué)檢測。在造模第7天（造模成功）后，各組大鼠ip相應(yīng)藥物、模型組ip生理鹽水，連續(xù)給藥7d，并在造模后第9、13天進(jìn)行各組大鼠左后肢行為學(xué)檢測。華蟾素低、中、高濃度注射液的配制：購買的華蟾素注射液原濃度為高濃度，將華蟾素原液與生理鹽水按3∶1稀釋后得到中濃度，按1∶1稀釋后得到低濃度，大鼠的給藥量為5mL/kg。1.4大鼠行為測試1.4.1大鼠的機(jī)械性痛行為檢測分別于造模前、造模后隔天檢測各組大鼠左右后肢機(jī)械痛閾值。將大鼠置于安靜環(huán)境中，室溫（22±1）℃，機(jī)械性痛覺超敏采用IITCvonFrey2391測定，將大鼠置于底為網(wǎng)格的特制有機(jī)玻璃內(nèi)，適應(yīng)一段時(shí)間待大鼠安靜后，將vonFrey2391的探針分別刺激大鼠左右后足腳掌中部皮膚，觀察大鼠縮足反應(yīng)，并記錄大鼠的機(jī)械性痛閾值。每只大鼠測定3次，取平均值，前后2次不同刺激間隔為10min。1.4.2大鼠皮膚多次刺激強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)分別于造模前、造模后隔天檢測各組大鼠左右后肢熱痛閾值。大鼠處于安靜環(huán)境中，室溫（22±1）℃，熱痛覺過敏采用輻射熱測痛儀，大鼠置于底為光滑玻璃的有機(jī)玻璃格子內(nèi)，適應(yīng)一段時(shí)間待大鼠安靜后，將強(qiáng)熱光束分別照射大鼠左右后足腳掌中心皮膚，引起大鼠縮爪反應(yīng)時(shí)間為大鼠縮爪潛伏期。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果將刺激強(qiáng)度設(shè)定為35%，每只大鼠測定3次，取平均值，2次間隔10min。為防止大鼠熱輻射燙傷，將自動(dòng)切斷電時(shí)間定為20s。1.5用針刺法檢測大鼠骨髓巴克信號(hào)通道相關(guān)蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)大鼠麻醉后，冰上取大鼠L4-6段脊髓勻漿1.6-髓間質(zhì)實(shí)驗(yàn)最后1d，大鼠麻醉后，冰上取出L4-6段脊髓，勻漿后離心取上清液。按ELISA試劑盒的說明進(jìn)行相關(guān)炎性因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的檢測。1.7統(tǒng)計(jì)處理運(yùn)用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料以2結(jié)果2.1假手術(shù)組與機(jī)械痛閾值比較各組大鼠分別于造模前（第0天）、造模后第2、5、7天與對(duì)照組相比，假手術(shù)組機(jī)械痛閾值與熱痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與假手術(shù)組相比，模型組從第5天開始機(jī)械痛閾值與熱痛閾值顯著降低，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表3。2.2華浚素對(duì)不同給藥組熱痛閾值與機(jī)械痛閾值的影響檢測各組大鼠熱痛閾值與機(jī)械痛閾值，造模前各組大鼠痛閾值無明顯差異（P>0.05）；與假手術(shù)組相比，造模后模型組與華蟾素各濃度組的熱痛閾值與機(jī)械痛閾值逐漸降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05、0.01）。與假手術(shù)組相比，假手術(shù)+華蟾素（高濃度）組熱痛閾值與機(jī)械痛閾值無明顯變化（P>0.05）。與模型組相比，給藥后華蟾素各濃度（低、中、高）組熱痛閾值與機(jī)械痛閾值較模型組升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05、0.01）。結(jié)果見表4、5。2.3熱痛閾值檢測根據(jù)連續(xù)注射華蟾素對(duì)骨癌痛大鼠熱痛閾值與機(jī)械痛閾值的行為影響結(jié)果，選擇高濃度的華蟾素檢測單次注射后對(duì)骨癌痛大鼠熱痛閾值與機(jī)械痛閾值的影響。在骨癌痛模型造模后第7天開始ip華蟾素注射液，并在單次注射后的0.5、1、2、4、6、8、24h內(nèi)檢測各組大鼠的熱痛閾值與機(jī)械痛閾值。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠熱痛閾值與機(jī)械痛閾值均降低，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；假手術(shù)+華蟾素組的熱痛閾值與機(jī)械痛閾值較假手術(shù)組未見明顯差異（P>0.05）。與模型組相比，予以華蟾素干預(yù)后，在注射后的0.5h內(nèi)，華蟾素組大鼠的熱痛閾值與機(jī)械痛閾值較模型組未見明顯升高(P>0.05）；在注射后的1、2、4、6、8、24h內(nèi)，華蟾素組大鼠的熱痛閾值與機(jī)械痛閾值較模型組明顯升高，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05、0.01）；且華蟾素在單次注射后的6h作用達(dá)到高峰而后作用緩慢減弱。結(jié)果見表6、7。2.4華燦素對(duì)骨腫瘤鼠骨骼穆克信號(hào)通道相關(guān)蛋白活性的影響2.5華浚素對(duì)骨髓細(xì)胞因子表達(dá)的影響連續(xù)給藥7d后，末次大鼠疼痛行為學(xué)檢測結(jié)束后處理動(dòng)物，冰上取脊髓，研磨后，采用ELISA進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞因子的檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明；與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠脊髓中相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）；與模型組相比，華蟾素組大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β、MCP-1的含量均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖2。3華光素對(duì)大鼠痛行為的影響大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，CIBP發(fā)生往往是由于腫瘤壓迫或浸潤周圍組織、腫瘤部位炎癥、癌細(xì)胞釋放等導(dǎo)致的神經(jīng)纖維的病理活化所引起MAPKs通路在調(diào)控細(xì)胞生長、增值、分化和凋亡等細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，是持續(xù)性疼痛發(fā)生的必要條件，在神經(jīng)細(xì)胞損傷后，MAPKs表現(xiàn)出明顯的磷酸化水平本實(shí)驗(yàn)研究中，通過大鼠患側(cè)與健側(cè)熱痛閾值與機(jī)械痛閾值的比較，發(fā)現(xiàn)CIBP模型大鼠只出現(xiàn)患肢的痛敏，予以中藥華蟾素干預(yù)后，能明顯提高模型組大鼠的痛閾值。隨后，進(jìn)行單次給藥、連續(xù)給藥及藥物濃度的比較，發(fā)現(xiàn)華蟾素的鎮(zhèn)痛作用具有濃度依賴性，濃度越大，作用越顯著，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用高濃度的華蟾素，單次給藥后的6h華蟾素的鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)，隨后鎮(zhèn)痛作用逐漸降低。在假手術(shù)組中予以華蟾素后，發(fā)現(xiàn)華蟾素對(duì)假手術(shù)組大鼠痛閾值無影響，也就是說，華蟾素并不能夠提高正常大鼠的痛閾值。進(jìn)行脊髓相關(guān)蛋白檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)模型組中MAPKs各相關(guān)蛋白的表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)；華蟾素組ip華蟾素注射液后，大鼠脊髓中p-JNK、p-p38蛋白的表達(dá)量下調(diào)，而p-ERK蛋白的表達(dá)未見明顯差異。由此得出華蟾素可能是通過抑制脊髓MAPKs信號(hào)通路相關(guān)蛋白（JNK、p38）的活化，減少細(xì)胞因子釋放，從而減輕中樞敏化作用發(fā)揮緩解CIBP的作用。采用Westernblotting檢測