濕地松胚性愈傷組織增殖的影響因素分析

濕地松是柏樹科的一種速生樹種，屬于裸露的松科（pinaceae），在20世紀30年代引入中國。培養基的pH會影響培養基中外源激素和營養元素的作用效果，可能對培養物的生長狀況產生不同的影響本研究以濕地松優良無性系的胚性愈傷組織為研究材料，探究了不同pH、碳源和谷氨酰胺及其替代物丙谷二肽對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響，期望能夠獲得適合濕地松胚性愈傷組織增殖的主碳源種類及使用濃度，明確最優pH范圍，并回答谷氨酰胺能否被丙谷二肽替代的問題，以進一步降低培養成本，促進胚性愈傷組織迅速增殖并減輕褐化，為進一步提高濕地松胚性愈傷組織增殖的質量和數量奠定研究基礎。1材料和方法1.1合代新品系的誘導獲得胚性愈傷組織2019年6～7月從廣東臺山紅嶺種子園的濕地松精選種子園（混合代）中，采收優良單株自由授粉的未成熟球果，誘導獲得胚性愈傷組織。單種子來源的胚性愈傷組織獨立建立胚性無性系，從中選擇已繼代6次，增殖能力強，活力好的無性系PEE3-13進行本實驗。1.2測試方法1.2.1組織特征觀察從誘導的愈傷組織中選取直徑2～5mm大小的愈傷組織材料置于載玻片上，用2%醋酸洋紅和0.5%伊文思藍先后對其進行染色，在體視顯微鏡下觀察被染色的細胞團特征。鑒定出的胚性愈傷組織用于增殖培養。1.2.2細胞團繼代培養將愈傷組織置于Y0固體培養基表面進行繼代增殖，暗培養，23±1℃，每隔14d繼代1次，繼代時優選愈傷塊表面新生的細胞團進行繼代，以維持無性系的活力。Y0培養基以mP6為基本培養基1.2.3生物重復性試驗在Y0固體培養基成分不變的情況下，高壓滅菌前用1mol·L將PEE3-13的新生胚性愈傷稱量每個平板約0.7g，輕輕置于培養基表面，并均勻分成7塊，每塊約0.1g，記錄每個平板的初始接入質量，每個所設定pH條件下均接入10板作為10個生物學重復。將平板置于23±1℃，黑暗條件下進行培養，培養14d后，準確稱重此時平板上的胚性愈傷總質量并記錄。1.2.4紅塊糖對胚性愈傷組織增殖的影響以生工生物公司購買的蔗糖、麥芽糖及市場購買的精制白砂糖、紅塊糖為所測試的碳源種類，設置6個處理：30g·LPEE3-13的胚性愈傷組織的繼代和稱重方法同“1.2.2胚性愈傷組織增殖的最適pH篩選”，培養條件一致。1.2.5丙-谷二肽對胚性愈傷組織增殖的影響以Sigma公司購買的L-谷氨酰胺和廣州樂試生物科技有限公司購買的L-丙-谷二肽為所測試的有機氮源，設置4個處理：(1)不添加任何谷氨酰胺或丙谷二肽，(2)450mg·LPEE3-13的胚性愈傷組織的繼代和稱重方法同“1.2.2胚性愈傷組織增殖的最適pH篩選”，培養條件一致。1.3數據統計分析增殖率（%）=（每板培養14d后的質量-每板初始接入的質量）/每板初始接入的質量×100%(1)數據統計分析采用SPSSStasitics21.0軟件進行，使用Turkey法進行多重比較并用標記字母法表示差異顯著性（不同小寫字母代表在P<0.05水平差異顯著）。2結果與分析2.1胚頭和胚柄的結構利用濕地松未成熟球果誘導獲得的愈傷組織有兩種類型：胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。胚性愈傷組織染色后在體視鏡下可見分生組織細胞團組成的胚頭（EC,embryonalmasscells）和胚柄（SC,suspensorcells）結構對所獲得的無性系PEE3-13的愈傷組織進行染色鑒定，體視顯微鏡觀察發現其具有胚頭及胚柄結構，胚頭細胞團密集，胚柄細胞呈長條形，緊隨在胚頭細胞團后（見圖1）。因此，所鑒定的愈傷組織由胚性細胞組成，為胚性愈傷組織。2.2不同ph對濕地松培養基的影響對增殖培養基滅菌前和滅菌后的pH分別進行了測定，結果表明，滅菌前培養基調整至某一確定的pH后，在滅菌后仍會發生較大變化。當滅菌前的pH小于6.0時，滅菌后的pH升高，滅菌前pH越低，升高越多；當滅菌前的pH大于或等于6.0時，滅菌后的pH降低，滅菌前pH越高，降低越多（見表1）。因此，滅菌前調整培養基的pH至固定值并不能代表培養時該培養基的實際pH。在不同pH條件下，胚性愈傷的培養后質量和增殖率有很大差別（見表1）。當滅菌前pH調整為6.0，滅菌后pH變為5.68時，胚性愈傷的培養后質量和平均增殖率最高，平均增殖率可達到436.20%，但與滅菌前調整pH為7.0時沒有顯著差異，說明培養基實際pH范圍為5.68～6.28時，均適宜胚性愈傷組織的生長。當滅菌前pH調整為4.0，滅菌后pH變為4.77時，胚性愈傷的培養后質量和平均增殖率最低，此時培養基凝固困難，呈凝膠流動狀。當滅菌后pH未落在最適范圍內時，平均增殖率均有所下降，說明胚性愈傷組織在增殖過程中對pH仍較為敏感。綜上，在培養基滅菌前將pH調節至6.0～7.0左右，能夠保證滅菌后pH在最適范圍內，最大限度降低pH對胚性愈傷組織增殖的影響。2.3不同碳源對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響利用市售的精制白砂糖、紅塊糖與試劑公司購買的蔗糖和麥芽糖進行胚性愈傷組織增殖的比較研究，結果表明，不同碳源對濕地松胚性愈傷組織增殖的影響非常顯著（見表2）。增殖培養后質量及增殖率均在使用30g·L因此，市售精制白砂糖相比于純蔗糖，更適宜濕地松胚性愈傷組織的增殖，但具體是其中的何種成分促進了增殖，還需進一步探索；而麥芽糖極不適宜濕地松胚性愈傷組織的增殖，即使濃度提高至45g·L2.4谷氨酰胺替代谷氨酰胺通過添加谷氨酰胺以及不同濃度的丙谷二肽，觀察丙谷二肽能否替代谷氨酰胺用于胚性愈傷組織的增殖培養，結果表明，丙谷二肽添加后，即使增加使用濃度，培養后質量及增殖率均顯著低于添加谷氨酰胺的處理組（見表3），說明丙谷二肽無法在濕地松胚性愈傷組織的增殖培養中替代谷氨酰胺。未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的處理組與添加谷氨酰胺的處理組相比，培養后質量及增殖率差異雖然略低，但差異不顯著（見表3）；進一步在繼代后觀察到未添加谷氨酰胺或丙谷二肽的處理組的胚性愈傷組織更容易褐化，多次繼代后容易出現增殖困難和死亡，說明谷氨酰胺的缺乏即使在培養當代未顯著影響增殖率，仍會潛移默化地影響胚性愈傷組織的細胞活力，使細胞活力降低。3體胚增殖過程胚性愈傷組織的增殖是松樹體細胞胚胎發生的一個重要環節，胚性愈傷組織可在適當的培養基上長期繼代培養，并具有發育為體細胞胚胎，萌發形成體胚幼苗的能力。影響針葉樹胚性愈傷組織的增殖的因素有很多，其中包括碳源成分及濃度、微量元素、激素和瓊脂的濃度、pH等，并且這些因素一直是體胚細胞胚胎發生過程研究的重點。2003年，曹新祥等人綜述了植物組織培養中pH變化的有關問題：培養基的pH能夠影響細胞的分裂和細胞增殖，當環境pH高于8時可啟動細胞的分裂，偏低則抑制細胞分裂；pH還可影響植物材料的呼吸代謝狀況、激素進出胞內和作用胚性愈傷組織在增殖時期，基本上不進行光合作用，需要額外添加碳水化合物作為能量。培養基中的碳源通常是由糖類提供。蔗糖是松屬胚性愈傷組織增殖過程中最常用的碳源之一，常規使用濃度在10～30g·L氮元素對于植物的生長發育是至關重要的，在針葉樹的體胚生長發育過程中，所需的氮全部依賴培養基供給，且有研究