保元抗癌口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高

寶元抗癌口服是解放軍總醫(yī)院的非標(biāo)準(zhǔn)制劑。這是由黃原、西洋參、半枝蓮和仙鶴草組成的11種中藥組成的。具有益氣養(yǎng)陰、健脾補(bǔ)腎、清熱解毒、抗癌作用。主要用于各種腫瘤的治療或腫瘤術(shù)后的恢復(fù)和化療。臨床使用多年，質(zhì)量可靠，療效確切，具有較高的安全性和有效性。保元抗癌口服液的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較為落后，有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)處方中黃芪、西洋參進(jìn)行薄層鑒別，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。為了加強(qiáng)制劑質(zhì)量控制，滿足中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高要求，本研究嘗試新增白花蛇舌草、半枝蓮、白術(shù)的薄層鑒別，新增黃芪甲苷的含量測(cè)定，以期提高制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到有效控制藥品質(zhì)量的目的。1材料表面1.1超聲儀器和設(shè)備LC-20AT高效液相色譜儀(島津)；YP502N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；列孔型電熱恒溫水浴鍋(天津市中環(huán)科技開(kāi)發(fā)公司)；GoodLook-1000型全自動(dòng)薄層色譜成像系統(tǒng)(上海科哲生化科技有限公司)。1.2藥物質(zhì)量、藥材保元抗癌口服液(解放軍總醫(yī)院，批號(hào)：190701,190702,190703)；黃芪甲苷對(duì)照品(北京曼哈格生物科技有限公司，批號(hào)：B0005705；純度：90.6%)；黃芪、西洋、白花蛇舌草、半枝蓮、白術(shù)對(duì)照藥材(批號(hào)：120974-201311,120997-201309,121183-201404,121203-201003,120925-201611)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙醇、無(wú)水乙醇、甲醇、正丁醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚(30～60℃)、環(huán)己烷、硫酸、鹽酸、冰醋酸、氨水、氫氧化、三氯化鋁、對(duì)二氨基苯甲醛均為分析純。硅膠G板、聚酰胺薄膜(青島海洋化工廠)。2方法和結(jié)果2.1包裝侵權(quán)2.1.1黃2.1.4陰性樣品溶液取本品10mL，加甲醇30mL，超聲處理30min，放冷，離心，取上清液，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL溶解，超聲10min，放冷，過(guò)濾，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。取缺半枝蓮藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取半枝蓮對(duì)照藥材1g，加甲醇20mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(3∶2∶2∶1.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1F。2.1.5檢測(cè)方法及設(shè)備取本品20mL，用石油醚(30～60℃)充分振搖2次(25mL,20mL)合并，蒸干，殘?jiān)?.5mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取缺白術(shù)藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取白術(shù)對(duì)照藥材1g，加水50mL，煎煮30min，放冷，濾過(guò)，濾液同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(7∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%對(duì)二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱6～8min，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖1G。2.2hplc黃棕櫚葉含量的測(cè)定2.2.1在鉻條件下進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)WondaSilC2.2.2對(duì)照藥材的制備(1)對(duì)照品溶液的制備：取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，混勻，即得。(2)供試品溶液的制備：精密量取供試品10.00mL于50mL離心管中，加入30mL水飽和正丁醇溶液，充分萃取5min，靜置分層后，取水飽和正丁醇層于150mL分液漏斗中，水層繼續(xù)用30mL水飽和正丁醇重復(fù)萃取3次，合并正丁醇液于分液漏斗中。用氨試液充分洗滌2次(輕輕振搖防止乳化)，每次40mL，棄去氨試液，正丁醇液于250mL平底燒瓶中，85℃旋蒸至干，放冷，殘?jiān)芗尤?.00mL甲醇溶解，密塞，過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，備用。(3)黃芪對(duì)照藥材的制備：取黃芪對(duì)照藥材細(xì)粉約0.5g(加甲醇25mL，加熱回流提取1h，放冷，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解)，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成對(duì)照藥材溶液。(4)陰性樣品溶液的制備：取缺少黃芪藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。2.2.3樣品前處理取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、對(duì)照藥材溶液及陰性樣品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品中黃芪甲苷與對(duì)照品及對(duì)照藥材在相同保留時(shí)間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。2.2.4加甲醇溶液制備精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品24.55mg，置10mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為2224.23μg·mL2.2.6試品溶液制備精密量取樣品(批號(hào)：190701)6份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，平行制備6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果表明，黃芪甲苷含量為0.012%,RSD=3.1%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。2.2.7加標(biāo)的回收率測(cè)得各添加水平的平均回收率分別為104.0%(RSD=2.6%)、97.6%(RSD=1.5%)、103.0%(RSD=1.4%)，所有加標(biāo)的平均回收率為101.5%(RSD=3.4%)。滿足方法的回收率要求，顯示方法的準(zhǔn)確度良好，回收率均在90%～108%，符合要求。2.2.1穩(wěn)定性試驗(yàn)將制備好的供試品溶液(批號(hào)：190701)和對(duì)照品溶液，在室溫放置0,2,4,6,8h后分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定黃芪甲苷，供試品溶液和對(duì)照品溶液中黃芪甲苷峰面積RSD分別為0.09%和0.08%(n=5)，均<3%，表明上述溶液在室溫放置8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.2.1樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定取3批中試樣品(批號(hào)：190701,190702,190703)，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，黃芪甲苷含量分別為0.012%,0.011%,0.011%。3討論3.1薄層色譜鑒別為了進(jìn)一步提升標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)本品的制備工藝及藥味的主要成分的化學(xué)性質(zhì)，對(duì)方中其他藥味進(jìn)行薄層色譜鑒別篩選研究。參照中國(guó)藥典2015年版一部，新增白花蛇舌草、半枝蓮、白術(shù)的薄層鑒別，比移值適中，專屬性強(qiáng)，空白無(wú)干擾，可以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案中。參照中國(guó)藥典2015年版一部及相關(guān)文獻(xiàn)試驗(yàn)，仙鶴草3.2化學(xué)成分的檢測(cè)黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的作用。主要含有三萜皂苷、黃酮類化合物、多糖以及氨基酸等，為處方中君藥。參照中國(guó)藥典2015年版一部，黃芪藥材中黃芪甲苷含量測(cè)定方法，采用蒸發(fā)光檢測(cè)器，乙腈-水為流動(dòng)相，通過(guò)多次試驗(yàn)，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例、漂移管溫度及載氣量，最終確定檢測(cè)條件，結(jié)果黃芪對(duì)照藥材溶液在與黃芪甲苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置有相同的色譜峰出現(xiàn)，空白溶劑及陰性對(duì)照溶液在黃芪甲苷峰位置處無(wú)相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，不干擾本品含量測(cè)定。為了考察微小變動(dòng)因素對(duì)本品含量測(cè)定的影響，調(diào)節(jié)流速(0.8,1.0,1.2mL·min3.3黃芪甲苷的提取、鑒別和鑒別中國(guó)藥典2015年版一部中規(guī)定：黃芪藥材中黃芪甲苷含量按干燥品計(jì)算，含黃芪甲苷不得<0.04%。處方中黃芪350g，制成口服液1000mL。經(jīng)檢測(cè)，黃芪藥材中黃芪甲苷含量0.057%,3批保元抗癌口服液中黃芪甲苷平均含量為0.011g·(100mL)取本品30mL，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用氫氧化鈉試液洗滌2次，每次20mL，棄去氫氧化鈉洗滌液，再用20mL水洗滌正丁醇提取液1次，棄去水洗液，將正丁醇提取液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。取缺少黃芪藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1A和1B。2.1.2陰性樣品的檢測(cè)取西洋參對(duì)照藥材粉末1g，加甲醇25mL，加熱回流提取1h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，照“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取缺西洋參藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)5～10℃放置12h的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1C和1D。2.1.3陰性樣品溶液取本品10mL，加乙醇20mL，攪拌搖勻，離心，取上清液置水浴蒸至近干，加硅藻土適量攪勻，干燥，加無(wú)水乙醇30mL浸漬30min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL溶解作為供試品溶液。取缺白花蛇舌草藥材的陰性樣品，同法制成陰性樣品溶液。另取白花蛇舌草對(duì)照藥材1g，加水50mL，回流1h，放冷，過(guò)濾，濾液濃縮至約10mL，加乙醇20mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙醇-濃氨試液(3∶7.5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以鹽酸乙醇(1→3)溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)