RNA濃度測(cè)定（紫外光吸收法）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私庾贤馕辗y(cè)定RNA濃度的原理。熟悉紫外分光光度計(jì)的基本原理和使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)（—C=C一C=C一），能夠強(qiáng)烈吸收250~280nm波長(zhǎng)的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm處。遵照Lambert-Beer定律，可以從紫外光吸收值的變化來(lái)測(cè)定RNA物質(zhì)的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測(cè)定核酸物質(zhì)時(shí)均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)行。三、實(shí)驗(yàn)器材UV-9100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。容量瓶100ml（*1）試管1.5cm*15cm（*9）吸管四、實(shí)驗(yàn)試劑酵母RNA標(biāo)準(zhǔn)RNA試劑（100微克每毫升）NaOH溶液五、實(shí)驗(yàn)步驟RNA粗品的制備稱(chēng)取8g干酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加熱30min,經(jīng)常攪拌。冷卻，然后4000r|min離心15分鐘。取上清液，加入95%酸性乙醇40ml，邊加邊攪。加畢，靜置5-10min離心。濾液先用95%乙醇洗2次，繼而用無(wú)水乙醇洗2次，洗滌時(shí)可用細(xì)玻璃棒小心攪動(dòng)沉淀。乙醇濾干后，濾渣即為粗RNA。樣品的處理：稱(chēng)取0.2~0.25g粗品RNA，加2ml0.2%NaOH和1mlH2O溶解，調(diào)成糊狀，再加入40~50mlH20,溶解，調(diào)PH至7.0,后定容至100ml（再取2ml定容至100ml待測(cè)，此過(guò)程重復(fù)三次）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取六支試管，編號(hào)，按表加入試劑六、作表作圖入:260nmRNAm:0.2133g試管123456ABC標(biāo)準(zhǔn)RNA(ML)012345蒸餾水(ml)1098765RNA濃度|ig|ml01020304050吸光度0.0000.2320.4330.6270.8170.9810.5190.5230.522樣品RNA質(zhì)量為25.3|ig|mlx50x100ml=0.1265g樣品RNA純度：0.1265寧0.2133=59.3%七、誤差分析根據(jù)理論在5~45yg|ml與吸光值成正比，而該范圍的兩個(gè)端點(diǎn)沒(méi)有取到，六號(hào)試管RNA濃度已經(jīng)超出了范圍，不能作為曲線的參考值。因?yàn)槭亲隽巳纹叫性囼?yàn)，所以在樣品三次定容時(shí)可能有些許誤差。在配置標(biāo)準(zhǔn)RNA濃度時(shí)可能導(dǎo)致RNA濃度有些許的誤差。樣品中可能含有少量蛋白質(zhì),DNA,對(duì)紫外光也有強(qiáng)吸收作用會(huì)產(chǎn)生誤差。八、思考題1．采用紫外光吸收法測(cè)定樣品的核酸含量，有何優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)？用紫外光吸收法測(cè)定樣品的核酸含量，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，并且待測(cè)核酸樣品中含有的微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)，產(chǎn)生較小測(cè)定誤差。但該法在測(cè)定樣品內(nèi)混雜有大量的上述吸收紫外光物質(zhì)時(shí)，則會(huì)產(chǎn)生較大測(cè)定誤差，需要設(shè)法事先除去。2．若樣品中含有核苷酸類(lèi)雜質(zhì)，應(yīng)如何校正？當(dāng)樣品中含有核苷酸類(lèi)雜質(zhì)時(shí)，需要加鉬酸銨-過(guò)氯