生物工藝學第二章

疫苗的種類及生產工藝流程

生物工藝學第二章

疫苗的種類及生產工藝流程1內容背景疫苗免疫的原理疫苗的分類及應用內容背景2一、背景定義：疫苗是利用病原微生物及其代謝產物，經過人工減毒、滅活或基因工程等方法制成，用于預防傳染病的自動免疫制劑。

十一世紀中國（約北宋時期）及阿拉伯的醫生就知道將患有天花之病患者身上的痂取下磨成粉末，吹到健康人鼻腔以預防天花。英國醫生EdwardJenner在1796年更證明了接種牛痘可預防天花。接種疫苗是預防一些傳染病最有效、最經濟的措施。一、背景定義：疫苗是利用病原微生物及其代謝產3二、疫苗免疫的原理二、疫苗免疫的原理4三、疫苗的分類及生產應用細菌性滅活疫苗細菌性活疫苗病毒疫苗三、疫苗的分類及生產應用細菌性滅活疫苗5項目一細菌性滅活疫苗制造項目一細菌性滅活疫苗制造6滅活細菌疫苗通用制造程序

菌種的選擇菌液培養滅活

配苗濃縮

細菌性滅活疫苗簡稱滅活菌苗，包括百白破疫苗、流行性感冒疫苗（以下稱流感疫苗）、狂犬病疫苗和甲肝滅活疫苗，雖種類多樣，但制造程序通用。一、細菌性滅活疫苗制造滅活細菌疫苗通用制造程序菌種的選擇菌液7一、細菌性滅活疫苗制造（一）菌種與種子

1.菌種

制苗用菌種多數為毒力強、免疫原性優良的菌株，通常使用1-3個品系，均由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監察所傳代、鑒定、凍干保存和供應。各種用于制造菌苗的菌種應按規定定期復壯，并進行形態、培養特性、菌型、抗原性和免疫原性鑒定，合格菌種準許用于制苗。2.種子培養將經鑒定符合標準的菌種接種于菌苗生產規程中所規定的培養基進行增殖培養，經純粹檢查、活菌計數達到標準后即為種子液，用于菌苗生產。種子液通常保存于2-8C冷暗處，不得超過規程規定的使用期限。菌種的選擇菌液培養滅活濃縮配苗一、細菌性滅活疫苗制造（一）菌種與種子1.菌種2.種子培養8（二）菌液培養

大量生產的細菌培養方法甚多，既有手工式的，也有機械化或自動化的培養方式。機械化或自動化的培養方式通稱為反應缸培養法，可供選擇的菌液培養法有：液體靜置培養法、液體深層通氣培養法、透析培養法及連續培養法等。

菌液培養也可采用固體培養法，該方法易獲得高濃度的細菌懸液，易稀釋成不同濃度，且含培養基的成分較少，所以比較適用于制備診斷用的抗原。一、細菌性滅活疫苗制造菌種的選擇菌液培養滅活濃縮配苗（二）菌液培養大量生產的細菌培養方法甚多，9（三）滅活

滅活菌苗通常根據細菌的特性加入最有效的滅活劑，采取最適當的滅活條件進行，幾種滅活菌苗的滅活方法如表所示。表幾種滅活菌苗的滅活方法

一、細菌性滅活疫苗制造菌種的選擇菌液培養滅活濃縮配苗（三）滅活滅活菌苗通常根據細菌的特性加入10（四）濃縮

為提高某些滅活菌苗的免疫力，在培養過程中采取提高菌數的基礎上，再通過濃縮方法達到目的。常用的濃縮方法：氧化鋁膠吸附沉淀法離心沉降法羧甲基纖維沉淀法

以上方法可使菌液濃縮一倍以上。此外，有些細菌在生長過程中產生分子量小的可溶性抗原（如豬丹毒桿菌產生的糖蛋白）也可經氫氧化鋁吸附濃縮；將破傷風脫毒液按鹽酸—食鹽法處理，以作進一步精制成提純破傷風類毒素。一、細菌性滅活疫苗制造菌種的選擇菌液培養滅活濃縮配苗（四）濃縮為提高某些滅活菌苗的免疫力，在11

（五）配苗與分裝

由于滅活菌苗所用的佐劑不同，所以配苗方法也不相同。

氫氧化鋁菌苗：可在加入甲醛滅活的同時，按比例加入氫氧化鋁膠配制；也可在菌液經甲醛滅活后再按比例加入氫氧化鋁膠配苗。有的廠油佐劑菌苗的配制程序為：于滅菌的油乳劑135m110號白油、11.4m1Span-85、3.6mlTween80混合液中，在邊攪拌下加入等量甲醛滅活菌液配制。

配苗和分裝：應充分混勻，及時塞塞、貼簽或印字。一、細菌性滅活疫苗制造菌種的選擇菌液培養滅活濃縮配苗（五）配苗與分裝由于滅活菌苗所用的佐劑不12項目二細菌性活疫苗制造項目二細菌性活疫苗制造13弱毒菌種多系凍干品，由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監察所傳代、鑒定、保存與分發，少數由國家指定單位鑒定、保存與供給。菌種使用前應按規程規定進行復壯、挑選，并作形態、特性、抗原性和免疫原性鑒定，符合標準后方可用于制苗。將檢定合格的菌種接種子于規定的培養基，按規定的條件增殖培養，經純粹檢查及有關的檢查合格者即可作為種子液。種子液通常在0～4C可保存2個月，在保存期內可作為菌苗生產的批量種子使用。

細菌性活疫苗多指弱毒菌苗，目前我國使用的減毒活疫苗包括卡介苗、脊灰疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎減毒活疫苗、風疹減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗等。（一）菌種與種子二、細菌性活疫苗制造菌種的選擇菌液培養濃縮配苗弱毒菌種多系凍干品，由中國藥品生物制品檢定所或中國獸藥監察所14按1%～3%量將種子液接種于培養基，然后依不同菌苗要求進行培養。如豬丹毒弱毒菌須在在深層通氣培養中加入適當植物油作消泡劑，通入過濾除菌的熱空氣進行培養制造菌液如人用炭疽活疫苗、卡介苗經固體表面培養完成后須按規定要求將菌苔洗下制成菌液菌液于0～4C暗處保存，待抽樣經純粹、活菌數等檢查合格后使用。（二）菌液培養二、細菌性活疫苗制造菌種的選擇菌液培養濃縮配苗按1%～3%量將種子液接種于培養基，然后依不同菌苗要求進行培15

經檢驗合格的菌液，按規定比例加入保護劑配苗，充分搖勻后隨即進行分裝，分裝量必須準確。分裝好的菌苗迅速送入凍干柜進行預凍、真空干燥，凍于完畢后立即加塞、抽空、封口，移入冷庫保存，并由質檢部門抽樣檢驗。（四）配苗與凍干

為提高某些弱毒菌苗的免疫效果，可進行濃縮，以提高單位活菌數，常用的依縮方法有吸附劑吸附沉降法、離心沉降法等，如于豬丹毒菌液內加入0.2%～0.25%羧甲基纖維素(CMC)進行濃縮，也可用離心沉淀濃縮。濃縮菌液應抽樣作純粹、活菌數等檢查。（三）濃縮二、細菌性活疫苗制造菌種的選擇菌液培養濃縮配苗經檢驗合格的菌液，按規定比例加入保護劑配苗，16流程圖1——細菌疫苗制造工藝流程蛋白質、肉浸液等原料培養基細菌分離菌種弱毒菌種配置、滅菌鑒定減毒檢驗配制滅菌檢驗配制滅菌原料佐劑滅活菌液配苗、乳化滅活疫苗培養菌苗原液配苗活疫苗保護劑菌液分裝、凍干分裝滅活原料活化種子流程圖1——細菌疫苗制造工藝流程蛋白質、肉浸液等原料培養基細17項目三病毒疫苗制造

病毒性禽胚培養疫苗制造病毒性細胞培養疫苗制造病毒性動物組織疫苗制造項目三病毒疫苗制造病毒性禽胚培養疫苗制造18一、病毒性禽胚培養疫苗制造

受精卵應來自SPF雞群，至少源于未用抗生素藥物的非免疫雞群，以免受母源抗體的干擾和殘留抗生素的影響。從受精卵入孵開始至培養全過程都應保持無菌，要求一定的溫度和濕度，且需不斷翻動，然后選擇。選擇一定日齡、發育正常的胚用于接毒培養。

痘病毒、正粘病毒、副粘病毒和皰疹病毒等一類生物制品，目前仍然利用禽胚特別是雞胚制備，如雞新城疫苗、禽流感疫苗、犬瘟熱雞胚弱毒疫苗等。禽胚疫苗生產的原材料來源方便、質量比較容易控制，制造程序簡單，不需要過高的設備條件，生產的疫苗質量可靠。（一）雞胚選擇雞胚選擇種毒與毒種繼代接毒與收獲配苗一、病毒性禽胚培養疫苗制造受精卵應來自SP19（二）種毒與毒種繼代

目前適應于雞胚的種毒多系弱毒，包括自然弱毒與人工培育的弱毒兩類。各種制苗用的種毒多數由國家菌毒種保藏部門或指定單位保存，保存的種毒多為凍干毒。凍干毒種需按規定要求在雞胚繼代復壯，通常繼代3代以上，經檢定符合標準后方可作力生產疫苗的毒種，毒種檢定內容包括無菌檢驗、毒價測定和其他項目的檢定等。一、病毒性禽胚培養疫苗制造種毒與毒種繼代雞胚選擇接毒與收獲配苗（二）種毒與毒種繼代目前適應于雞胚的種毒多20（三）接毒與收獲

雞胚接毒涉及接毒途徑和接毒量兩方面。根據不同的病毒與不同疫苗生產程序，選擇最佳接種途徑和接種量。接種途徑：絨毛尿囊膜接種11~12日齡胚尿囊腔接種9~11日齡胚羊膜腔接種10~12日齡胚卵黃囊接種5~8日齡胚如雞新城疫I系和II系毒采取尿囊腔接毒，前者接種10-3稀釋毒種0.1ml，后者接種10-4稀釋毒種0.1ml。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗采用絨毛尿囊膜接種50-100倍稀釋毒0.2ml。1.接毒一、病毒性禽胚培養疫苗制造接毒與收獲雞胚選擇種毒與毒種繼代配苗（三）接毒與收獲雞胚接毒涉及接毒途徑和接毒21

雞胚接毒后培養增殖的時間和溫度、濕度以及收獲的標準與內容物依不同的病毒和不同的疫苗而異。如雞新城疫I系疫苗，接毒后于38.5~39C、相對濕度60%~70%條件培養增殖，收集接毒后24~48h內死亡胚，置0~10C冷卻4~24h，收獲胚液，進行無菌檢驗，供制備濕苗用。也可收獲胚液、胎兒及絨毛尿囊膜混合制成乳劑制備凍干苗。鴨瘟雞胚化弱毒疫苗，則收集接毒后48~120h內死亡的雞胚，冷卻后采取絨毛尿囊膜、尿囊液、胎兒制造凍干苗用。2.培養收獲雞胚接毒后培養增殖的時間和溫度、濕度以及收獲22

按規定收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經無菌檢驗合格后即可進行配苗。

1.濕苗通常于雞胚液內，按每毫升加入青霉素和鏈霉素500~1000U，放置0~10C冷暗處處理后分裝。

2.凍干苗經無菌檢驗后合格的胚液或胚液、胎兒、絨毛尿囊膜乳劑，按比例加入保護劑，充分混合后濾過，于濾液內按每毫升加入青、鏈霉素500~1000U，混合后分裝凍干。

3.滅活苗

收獲雞胚液經無菌檢驗及毒價測定合格后，按規定比例加入平衡液，按不同病毒的滅活溫度、時間進行滅活，加入相應的佐劑，制備成滅活疫苗，放置4-10C保存。（四）配苗一、病毒性禽胚培養疫苗制造配苗雞胚選擇種毒與毒種繼代接毒與收獲按規定收獲的胚液、胎兒和絨毛尿囊膜乳劑經無菌檢23流程圖2——病毒性禽胚疫苗制造工藝流程受精卵禽胚毒株種毒滅活病毒液鑒定培育檢驗檢驗配制原料佐劑配苗、乳化滅活疫苗含病毒尿囊液或禽胚組織含病毒懸液配苗活疫苗保護劑分裝、凍干分裝滅活原料種子擴增收獲配制純化病毒懸液接種流程圖2——病毒性禽胚疫苗制造工藝流程受精卵禽胚毒株種24二、病毒性細胞培養疫苗制造

用于制苗用的種毒應經毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢定合格，通常為凍干品，由國家指定的苗毒種保藏部門檢定分發。領取的種毒應按規定在細胞繼代培養適應后用作毒種，制苗用毒種應按規定控制在一定代數以內，或為濕毒毒種，或為凍干毒種。

細胞培養疫苗有細胞培養滅活疫苗和細胞培養活疫苗兩類，前者多以強毒毒株培養增殖制造，后者則用弱毒毒株增殖生產，兩者的制造程序既有相同之處，又有區別。由于病毒不同與疫苗性質不同，所采用的細胞及細胞培養方法也有所不同（一）種毒與毒種繼代接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備二、病毒性細胞培養疫苗制造用于制苗用的種毒應25

制造疫苗用的細胞大體為原代細胞和傳代細胞兩類，根據病毒種類、疫苗性質與工藝流程選擇不同的細胞。選擇的依據包括：病毒的適應性高、毒價高、細胞來源方便、制備簡單、生命力強。如豬瘟兔化弱毒牛睪丸細胞疫苗采用犢牛睪丸原代細胞；脊髓灰質炎活疫苗選擇vero細胞；狂犬病弱毒細胞適應疫苗采取BHK21細胞增殖病毒等。（二）細胞制備接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備二、病毒性細胞培養疫苗制造

培養細胞和增殖病毒用的營養液又稱培養液，通常分為細胞培養用的生長液和病毒增殖用的維持液，兩者不同的之處通常只是生長液內含有5%-10%的血清；維持液血清濃度為2%-5%。不同細胞所需的營養成分和生長條件不盡相同。目前常用的細胞培養方法為靜止培養和轉瓶培養，至于微載體培養和懸浮培養在我國尚處于試驗之中。制造疫苗用的細胞大體為原代細胞和傳代細胞兩類，26（三）接毒與收獲

病毒接種培養有同步與異步之分，前者在細胞分裝同時或不久接種毒種，進行培養，如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細小病毒)；后者在細胞形成單層后接種毒種，如流行性乙型腦炎細胞培養疫苗。通常在細胞形成單層后傾去培養液，按1%-2%量接種毒種，經吸附后加入維持液繼續進行培養，待出現70%-85%以上細胞病變時即可收獲。病毒培養液收獲時間和方法依疫苗性質而定，可將培養瓶凍融數次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收取；或在病毒增殖培養過程中可收獲5-7次毒液，細胞毒液經無菌檢驗、毒價測定合格后供配苗用。

接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備二、病毒性細胞培養疫苗制造（三）接毒與收獲病毒接種培養有同步與異步27（四）配苗1．滅活疫苗不同滅活劑對不同病毒的作用也不同。向細胞毒液內按規定加入滅活劑，在一定的溫度下作用一定的時間，有的滅活劑還需加入阻斷劑中止滅活。滅活疫苗配置通常都需加入佐劑，充分混合、分裝，制成滅活疫苗。2．凍干苗細胞毒液內按比例加入保護劑或穩定劑，充分混合、分裝，進行冷凍真空干燥制成凍于疫苗。

接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制備二、病毒性細胞培養疫苗制造（四）配苗1．滅活疫苗接毒與收獲種毒與毒種繼代配苗細胞制28三、病毒性動物組織疫苗制造

病毒在易感動物體內可大量增殖，但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異，利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織制造的疫苗稱為組織疫苗(tissuevaccine)。動物組織疫苗包括動物組織滅活疫苗和動物組織弱毒活苗兩類，前者多數由強毒株制造，如豬瘟結晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗；后者均以弱毒株生產，如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。

動物質量直接影響到組織疫苗的質量，特別是對疫苗的安全性和效力有著決定性的作用，動物必須符合下列標準：

(1)應該是清潔級(二級)以上的等級實驗動物，即無規定的人獸共患性病原體動物；

(2)應是對所接種病毒易感性高的動物，即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實驗動物。（一）動物選擇觀察與收獲動物選擇配苗種毒與接種三、病毒性動物組織疫苗制造病毒在易感動物29

種毒既可用抗原性優良、致死力強的自然毒株臟器組織毒或強毒株增殖培養物，也可用弱毒株組織毒種。無論何種種毒都須經純粹、抗原性和免疫原性檢查合格后使用。接種途徑依病毒性質和目的而異，例如豬瘟結晶紫苗，采取豬肌肉注射血液毒種；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳靜脈注射脾淋毒種；狂犬病疫苗，用兔腦毒種接種綿羊腦內途徑感染。幾種動物常用的接種途徑如下：

1.腦內注射：顱前后中線5mm平行線與瞳孔橫線交叉處。

2.靜脈注射：家兔由耳靜脈注入；雞自翅下肢靜脈注入。

3.肌肉注射：選擇腿部、胸部、臀部等肌肉豐滿處注射。

4.皮下注射：家兔和豚鼠可選擇在腹部或后腿內注射。

5.腹腔注射：家兔與豚鼠可選腹股溝處刺入腹腔。（二）種毒與接種三、病毒性動物組織疫苗制造觀察與收獲動物選擇配苗種毒與接種種毒既可用抗原性優良、致死力強的自然毒株臟器30

動物在接種感染后應每天觀察和檢查規定的各項指標，指標或項目因不同病毒而異。常規觀察、檢查的項目如食欲、精神和活動狀態、體溫、糞便、尿和血液變化等。根據觀察的征象和檢查的結果選出符合要求的發病動物按規定方式剖殺，采取收集含毒量高的器官組織。如豬瘟結晶紫疫苗采取發病豬的血液制備；兔出血癥組織滅活疫苗采集病兔肝臟生產；狂犬病疫苗利用發病羊的羊腦組織制造。（三）觀察與收獲三、病毒性動物組織疫苗制造觀察與收獲動物選擇配苗種毒與接種動物在接種感染后應每天觀察和檢查規定的各項指311．組織滅活疫苗采取收獲的組織經無菌檢驗及毒價測定合格后，按規定比例加入平衡液和滅活劑（甲醛、酚、結晶紫等）制成勻漿，然后按不同病毒的滅活溫度、時間進行滅活。如狂犬病疫苗配制按腦組織1:4加入含有甘油及1%酚蒸餾水，于360.5C滅活7天制成；豬瘟結晶紫疫苗配制，按血毒4份，結晶紫甘油溶液1份混合，于37C~38C滅活6~8天。2.弱毒組織疫苗在無菌操作下剔除臟器上的脂肪與結締組織等，稱重后剪碎，加入適最保護劑制成勻漿，然后濾過扣除殘渣量，再按濾液中的實際組織量計算稀釋倍數，加入余量保護劑和青鏈霉素500~1000U(g/ml)，充分搖勻后置0~4C冷暗處處理一定時間后作無菌檢驗與毒價測定。合格者進行分裝，冷凍真空干燥制成凍干疫苗。（四）配苗三、病毒性動物組織疫苗制造觀察與收獲動物選擇配苗種毒與接種1．組織滅活疫苗（四）配苗三、病毒性動物組織疫苗制造觀察與32流程圖3——病毒性細胞疫苗制造工藝流程動物或胚胎組織毒株種毒滅活病毒消化鑒定培育培養檢驗檢驗配制原料佐劑傳代細胞配苗（混勻、乳化）滅活疫苗細胞懸液生長細胞配苗活疫苗保護劑原苗分裝、凍干分裝滅活原料原料細胞培養液配制剪碎種子鑒定擴增收獲配制滅菌流程圖3——病毒性細胞疫苗制造工藝流程動物或胚胎組織毒33重慶大學生物工藝學-第2章-疫苗生產工藝ppt課件34影響疫苗質量的因素毒種：毒種的優劣不僅影響疫苗的產量，而且也影響疫苗的質量，毒種不純會產生相互干擾，減毒活疫苗毒種若毒力回升易造成事故，因此毒種的選擇應挑選那些致病性低，免疫效價高而持久，抗原譜廣的，易增殖，便于生產，可在傳代細胞上傳代的毒種。培養病毒的細胞：細胞若有潛在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原體污染均不能用作疫苗生產。對此因素應嚴格檢查。此外若細胞本身發生轉化后，不宜于制備活疫苗，只能制備一些滅活疫苗或亞單位疫苗。培養液：培養細胞的營養液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常會出現某種程度的過敏反應，為此，應盡量使細胞適應于無血清蛋白的培養基中，以消除過敏源。甲醛滅活劑的使用：甲醛能使病毒滅活，但仍保持其抗原性，因此普遍用來制備滅活病毒疫苗，但要控制含量。影響疫苗質量的因素毒種：毒種的優劣不僅影響疫苗的產量，而且也35獲得質量優良、安全的產品，關鍵環節如下選擇優良的菌種和毒種，并保持其穩定性；選用適當的培養繁殖細菌與病毒等微生物的方法，包括優良的培養基、合乎要求的最好是標準化的實驗動物、禽胚及細胞；熟練掌握制品的生產工藝；準確掌握產品的檢驗方法和判定標準，嚴格按標準進行質量檢定。獲得質量優良、安全的產品，關鍵環節如下選擇優良的菌種和毒種，36疫苗的工業化生產簡介當我們拿到一個工程項目時，首先要做的就是明確設計的依據，這個依據應該包括：工藝技術、設備及公用輔助設施等有關基礎資料、生產規模、生產方式、生產班制,國家及行業主要有關規范和規定等，只有有了這些依據，我們下一步的工作才能做到有的放矢。然后就是確定工程范圍，明確我們要做的工作。疫苗的工業化生產簡介當我們拿到一個工程項目時，首先要做的就是37疫苗的工業化生產簡介通過以上簡單的介紹，我們知道了疫苗生產包括原液生產和制劑生產，為了得到真正的能用于實際的疫苗，我們就需要建設用于疫苗生產的車間，為疫苗的生產提供環境和物料方面的支持，那么建設一個疫苗生產車間需要哪些專業的配合呢，下面我們從四個方面分別進行說明。疫苗的工業化生產簡介通過以上簡單的介紹，我們知道了疫苗生產包38一、工藝平面布置要根據工藝流程來進行工藝平面布置，在這里最重要的一點就是不能出現交叉污染的風險，一、工藝平面布置要根據工藝流程來進行工藝平面布置，在這里最重39二、配管工藝管道是物流的通道，是疫苗生產的血管，它為生產提供原料、水、蒸汽等一般疫苗項目主要的工藝管道包括：注射用水、純蒸汽、純水、壓縮空氣、氧氣、氮氣、冷卻水、廢水等系統。二、配管工藝管道是物流的通道，是疫苗生產的血管，它為生產提供40工程實例工程實例41三、潔凈維護系統作為生物醫藥廠房，它與其它潔凈廠房的區別不是很大，主要在于：

1、生物醫藥廠房對維護結構（即壁板和頂板等）的密封性能要求更高；

2、生物醫藥廠房對維護結構的平整度要求更高；生物醫藥廠房建筑必須針對生物醫藥工程存在的氣溶膠泄露的可能發生環節進行全面考慮，在產生安全隱患的地方進行徹底的密封處理三、潔凈維護系統作為生物醫藥廠房，它與其它潔凈廠房的區別不是42三、潔凈維護系統生物醫藥廠房的維護結構的密封性能和平整度性能主要體現在以下幾個方面：1、雙圓弧天軌三、潔凈維護系統生物醫藥廠房的維護結構的密封性能和平整度性能43三、潔凈維護系統生物醫藥廠房的維護結構的密封性能和平整度性能