1、 酶的定義與分類定義：酶是具有生物催化功能的生物大分子。分類：蛋白類酶（P酶）和核酸類酶（R酶）2、 生物催化劑的特點①易失活（溫和性）：酶是由細胞產生的生物大分子，凡能使生物大分子變性的因素，如高溫、強堿、強酸、重金屬鹽等都能使酶失去催化活性。②高效性：反應速度是無酶催化/普通人造催化劑催化反應速度的106——1016倍。且無副反應③專一性：酶對催化的反應和反應物（底物）有嚴格的選擇性，只能催化一種或一類反應，作用于一種或一類物質，而一般催化劑沒有這樣嚴格的選擇性。絕對專一性：一種酶只能催化一種底物進行一種反應，甚至只能作用于異構體的一種（立體異構專一性）相對專一性：一種酶能夠催化一類結構相似的底物進行某種相同類型的反應。④可調節性：（1）酶濃度的可調性（誘導或抑制酶的合成；調節酶的降解）（2）通過激素調節酶活性（與細胞膜或細胞內受體相結合）（3）反饋抑制調節酶活性（如終端產物抑制）（4）抑制劑和激活劑對酶活性影響（5）別構調控、酶原的激活、共價修飾、同工酶等3、 米氏常數Km的意義Km值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。意義：①Km是酶的特性常數：與pH、溫度、離子強度、酶及底物種類有關，與酶濃度無關，可以鑒定酶。②可以判斷酶的專一性和天然底物。1/Km近似表示酶對底物的親和力：1/Km越大、親和力越大 Km較小者為主要底物③根據Km：判斷某［s］時v與Vmax的關系判斷抑制劑的類型④Km可幫助判斷某代謝反應的方向和途徑催化可逆反應的酶對正/逆兩向底物Km不同4、 可逆抑制作用分類、特點（書）P8（1）.不可逆抑制作用：抑制劑與酶的必需基團以共價鍵結合而引起酶活力喪失，不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復活。分為非專一性不可逆抑制劑，和專一性不可逆抑制劑。很多為劇毒物質，如重金屬、有機磷、有機汞、有機砷、氰化物、青霉素、毒鼠強等。（2）、可逆抑制作用：抑制劑與酶以非共價鍵結合而引起酶活力降低或喪失，能用物理方法除去抑制劑而使酶復活。①競爭性抑制：表觀Km增大Vmax不變；②非競爭性抑制：表觀Km不變Vmax減??；③反競爭性抑制：表觀Km減小Vmax減?。?、 蛋白類酶（P酶）的分類與命名（命名：課件）第1類，氧化還原酶。其催化反應通式為：AH2+B=A+BH2系統命名：“氫供體:氫受體氧化還原酶”被氧化的底物（AH2）為氫或電子供體，被還原的底物（B）為氫或電子受體。第2類，轉移酶；其反應通式為：AB+C=A+BC系統命名：“供體：受體某基團轉移酶”L-丙氨酸+2-酮戊二酸=丙酮酸+L-谷氨酸第3類，水解酶；其反應通式為：AB+H2O=AOH+BH。系統命名：“底物發生水解作用的化學鍵位置水解酶”第4類，裂合酶；其反應通式為：AB=A+B一般裂合酶在裂解反應方向只有一個底物，而在縮合反應方向卻有兩個底物。催化底物裂解為產物后，產生一個雙鍵。系統命名：“底物-裂解的基團-裂合酶”。第5類，異構酶；其反應通式為：A=B。系統命名：異構酶按照異構化的類型不同，分為6個亞類。命名時分別在底物名稱的后面加上異構酶、消旋酶、變位酶、表異構酶、順反異構酶等。第6大類，合成酶（或稱連接酶）。系統命名：“兩個底物的名稱連接酶。其反應通式為：A+B+ATP=AB+ADP+Pi（或A+B+ATP=AB+AMP+PPi）6、 酶活力測定方法:快速簡便準確①據酶催化的專一性選擇適宜底物.②據酶動力學性質確定溫度,pH值，底物濃度，激活劑濃度等?③酶與底物混合均勻,記下反應時間.④終止反應：測定產物生成量或底物減少量7、 酶活力單位如何定義、相對酶活力定義常用的酶活力單位有三種：A.國際單位（IU）:在標準條件（25r、最適pH、最適底物濃度）下，酶每分鐘催化Immol底物轉化，這樣的速度所代表的酶的活力即酶的量定義為1個國際單位（IU）。B.Katal:在最適條件下，酶每秒鐘催化1mol底物轉化，這樣的速度所代表的酶的活力即酶的量定義為1個Kat。C.自定義的活力單位：習慣上將測定時使用的反應速度的單位定義為酶的活力單位。8、 酶的比活力酶的比活力（純度）=酶活力/蛋白質含量（mg蛋白/ml酶液）（比活力越高，酶純度也越好。表示酶制劑純度的一個指標。）純化倍數二提純后比活力/提純前比活力（表示提純過程中純度提高的倍數。提純倍數越大，表示該方法純化效果越好。）總活力=酶活力單位數x酶液總體積回收率=提純后酶總活力/提純前酶總活力X100%。（表示提純過程中酶損失程度的大小?；厥章试礁撸瑩p失越小。）提純倍數：表示方法的有效程度。（一個好的純化步驟是回收率較高，提純倍數也較大。）9、 酶生產的各種方法及優缺點①提取分離法：采用各種提取分離技術從動物、植物的組織、器官、細胞或微生物細胞中將酶提取出來，再進行分離純化的技術過程。優點：設備較簡單，操作較方便。缺點：受生物資源，地理環境，氣候條件等影響②生物合成法：利用微生物細胞、植物細胞或動物細胞的生命活動而獲得人們所需酶的技術過程。優點：生產周期短，酶的產率高，不受生物資源、地理環境和氣候條件等影響。缺點：對發酵設備，工藝條件要求較高。③化學合成法：模擬酶一分子水平上模擬酶活性中心的結構特征和催化作用機制，設計并合成的仿酶體系。優點：酶的人工模擬和化學修飾，對認識和闡明生物體的行為和規律，設計和合成具有酶的催化特點又克服酶的弱點的高效非酶催化劑缺點：成本高，酶的化學結構已知。10、 酶合成的調節機制（）（1）轉錄水平的調節（2）轉錄產物的加工調節（3）翻譯水平的調節（4）翻譯產物的加工調節（5）酶降解的調節原核生物合成調節主要是轉錄水平的調節，分為以下三點：①酶合成的誘導：加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。已知分解利用乳糖的酶有：。-半乳糖苷酶；阡半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養基上時，細胞內無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長在乳糖培養基上時，細胞內有上述三種酶合成；（3）表明菌體生物合成的經濟原則：需要時才合成。②末端產物阻遏：由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。實驗：（1）大腸桿菌生長在無機鹽和葡萄糖的培養基上時，檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培養基中加入色氨酸，檢測發現細胞內色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現了菌體生長的經濟原則:不需要就不合成。③分解代謝物阻遏：指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。實驗：細菌在含有葡萄糖和乳糖的培養基上生長，優先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產生了兩個對數生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現象”11、 酶生物合成的模式（論述、圖文結合）比較酶產生與細胞生長的關系，可把酶生物合成模式分成4種類型：（1）同步合成型：酶的合成與細胞的生長同步進行。特點：（1）酶的生物合成可以誘導，不受分解代謝物阻遏和反應產物阻遏；（2）當除去誘導物或細胞進入平衡期后，酶的合成立即停止；（3）酶所對應的mRNA很不穩定。（2） 延續合成型：酶的合成伴隨著細胞的生長而開始，生長進入平衡期后，酶又延續合成一段時間。特點：（1）酶的合成可以誘導，不受分解代謝物或產物的阻遏；（2）酶所對應的mRNA相當穩定，在生長平衡期后仍可繼續較長時間用于酶的合成。（3） 中期合成型：酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，進入平衡期后，酶的合成隨之停止。特點：（1）酶的合成受到反饋阻遏；（2）所對應的mRNA不穩定。（4） 滯后合成型：當細胞進入平衡期后，才開始并大量積累酶。特點：（1）在對數生長期不合成酶（可能是受到分解代謝物阻遏的影響）；（2）所對應的mRNA穩定性高。c1)-5〉［￥M 1(in>(IVJ///■￡ x 一*. 時間th>二，二供WSS恭12、 影響酶生物合成的模式的主要因素是：（1）mRNA的穩定性；（2）培養基中阻遏物存在與否。規律：（1）mRNA穩定性高的，可在細胞停止生長后繼續合成其所對應的酶；（2）mRNA穩定性差的，酶的合成隨著細胞停止生長而終止；（3）受某些物質阻遏的，需在細胞生長一段時間或在平衡期后（解除阻遏），開始合成酶。（4）不受某些物質阻遏的，酶的合成隨著細胞生長而同步增長。13、 選擇最理想的酶合成模式——延續合成型14、 用于酶的生產的細胞必須具備的條件及各產酶微生物所產酶的類型。酶的產量高（這是最基本、最重要的要求）2.容易培養和管理（對培養基和工藝條件沒有特別苛刻要求，易生長繁殖，適應性強，易于控制，便于管理。）3.產酶穩定性好（穩定產酶，不易退化）4.利于酶的分離純化（最好分泌胞外酶，產量高且易純化）5.安全可靠，無毒性（要求產酶細胞及其代謝產物安全無毒，不會對人體和環境產生不良影響，也不會對酶的應用產生其他不良影響15、 培養基的配置有哪些因素、選擇原則所有發酵培養基都必須提供微生物生長繁殖和產物合成所需的能源，包括碳源、氮源、無機元素、生長因子及水、氧氣等。對于大規模發酵生產，除考慮上述微生物的需要外，還必須重視培養基原料的價格和來源。①碳源：提供能量；構成細胞，酶的重要組成元素。考慮分解代謝物阻遏作用及酶生物合成誘導作用。原料來源，價格，對發酵工藝條件及酶的分離純化的影響等。②氮源：蛋白質及核酸等組分的重要元素之一；各種酶分子的組成元素。有機氮：（異養型細胞，動物細胞）無機氮：（自養型細胞，植物細胞）注意比例：銨鹽與硝酸鹽、碳元素與氮元素。③無機鹽：組成元素，調節pH值、滲透壓和氧化還原電位。④生長因素。細胞生長繁殖所必需的微量有機化合物。一般添加含有多種生長因素的天然原料的水解物：酵母膏，麥芽汁，麩皮水解液等。16、 溶解氧的調節控制方法1）調節通氣量：增大通氣量，提高溶氧速率。2）調節氧分壓：提高氧分壓，增加氧的溶解度，提高溶氧速率。3）調節氣液接觸時間：延長氣液接觸時間（增設檔板），提高溶氧速率。4）調節氣液接觸面積：增加氣液接觸面積，提高溶氧速率。5）改變培養液性質等來實現：改變培養液組分或濃度，降低粘度；設消泡裝置或消泡劑。17、提高酶產量的措施1.菌種選育（1）誘變育種①使誘導型變為組成型——選育組成型突變株②使阻遏型變為去阻遏型（2）基因工程育種2.條件控制：（1）添加誘導物（2）控制阻遏物濃度（3）添加表面活性劑（增加細胞膜通透性，利于胞外酶分泌；提高酶穩定性及催化能力。）（4）添加產酶促進劑：作用機制不清18、細胞生長動力學細胞生長速率與細胞濃度成正比：Rx=dX/dt=口X（u:比生長速率）莫諾德方程： 'dtXKs+S只存在一種限制性基質時:Ks（莫諾德常數）：比生長速率達到最大比生長速率一半時的限制性基質濃度。即呻0.5旦m時，S=Ks（S為限制性基質濃度，Pm為最大生長速率，當S>>Ks時，4旦m；當^=0.5Mm時，S=Ks）在穩態時，游離細胞連續發酵的生長動力學方程式為：Rx=dx/dt=（P-D）X D：稀釋率D=0，分批發酵;D<u,細胞生長速率+，細胞濃度增加；D=u,細胞生長速率0，細胞濃度恒定;D>u,細胞生長速率-，細胞濃度下降,S升高,u回升；D>um,細胞濃度趨于零。19、 細胞產酶模式不同，產酶速率與細胞生長動力學關系也不同宏觀產酶動力學公式：dE/dt=（aM+P）xX一細胞濃度；u一細胞比生長速率；a一生長偶聯的比產酶系數；p一非生長偶聯的比產酶速率。細胞產酶模式不同，產酶速率與細胞生長動力學關系也不同同步合成型：生長偶聯型p=0，dE/dt=aMX中期合成型：特殊生長偶聯型p=0，dE/dt=aMX；有阻遏存在時，a=0，無酶產生dE/dt=0，阻遏解除后才開始合成酶.滯后合成型：非生長偶聯型a=0,dE/dt=pX延續合成型：部分生長偶聯型，a尹0，p尹0 dE/dt=aMX+pX20、 固定化細胞產酶動力學固定化細胞連續產酶動力學公式：dX/dt=pgXg+（uf-D）XfD<uf,游離細胞濃度越來越高，直至平衡；SS''D>uf，游離細胞濃度越來越低，直達新的穩態;固定化細胞不受影響，故可在高稀釋率下連續發酵;D=uf,細胞濃度達動態平衡.21、 固定化細胞發酵產酶的特點（1）提高產酶率：細胞密度增大---生化反應加速---產酶率提高。（2）可以反復使用或連續使用較長時間：不易脫落流失。（3）基因工程菌的質粒穩定，不易丟失。（4）發酵穩定性好：細胞受載體保護，pH和T適應性寬。（5）縮短發酵周期，提高設備利用率。（6）產品容易分離純化。（7）適于胞外酶等胞外產物的生產。22、 固定化細胞發酵產酶的工藝條件控制：與游離細胞發酵大同小異，需特別注意的幾個問題：（一）固定化細胞的預培養：先預培養，使固定在載體上的細胞生長繁殖，長好后，再用于發酵產酶，其培養基和工藝條件可以相同或不同。（二）溶解氧的供給：由于受到載體的影響，使氧的供給成為主要的限制性因素。解決辦法：（1）加大通氣量（強烈攪拌會破壞固定化細胞）；（2）改變固定化載體，如少用瓊脂等對氧擴散不利的載體；（3）過氧化氫酶與細胞共固定化，培養基加入適量的H2O2；（4）降低培養基的濃度，以降低培養基的粘度。（三）溫度的控制：連續發酵時，由于稀釋率較高，反應器內溫度變化較大，先預調流加液溫度。（四）培養基成份的控制：某些固定化載體的結構會受到某些成份的影響，如過量的磷酸鹽會破壞海澡酸鈣凝膠制備的固定化細胞。23、 固定化原生質體的特點1.變胞內產物為胞外產物；2.提高產酶率；3.穩定性較好；4.易于分離純化。24、 固定化原生質體發酵產酶的工藝條件及其控制1.滲透壓的控制；2.防止細胞壁的再生；3.保證原生質體的濃度。25、 植物細胞培養的特點1）提高產率：紫草細胞培養生產紫草寧，比產率（mg/d.g）提高830倍。2）縮短周期：生產周期一般15-30天。3）易于管理，減輕勞動強度：在人工控制條件的生物反應器中生產。4） 提高產品質量：主要產物產率高，雜質較少，減少有害物質污染，產物易于分離純化。5） 其他:注意光照，對前切力敏感.26、 細胞破碎方法及其原理機械破碎：通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。方法有：搗碎法、研磨法、勻漿法。物理破碎：通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。方法有：溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法?；瘜W破碎：通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎。方法有：有機溶劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿;表面活性劑：Triton、Tween。酶促破碎：通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎。方法有：自溶法、外加酶制劑法27、 細胞破碎確認1.直接測定破碎前后的細胞數2.測定導電率。3.測定釋放的蛋白質量或酶活力。28、 鹽溶:大多數蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現象。鹽析：在鹽濃度達到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現象。29、 影響酶提取的主要因素1溫度：不影響酶活性條件下適當提高溫度。2pH值：避開酶的等電點，不宜過高及過低。3提取液體積：過量提取液不利于分離純化，為原料體積3-5倍。4其他：顆粒小，適當攪拌，適當延長提取時間等可以提高提取率。適當加入某些保護劑：底物、輔酶、抗氧化劑等。30、 沉淀分離方法（1） 鹽析沉淀法：利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質分離（2） 等電點沉淀法（沉淀不完全，常聯合其他方法）利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點這一特性，通過調節溶液的pH值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離（3） 有機溶劑沉淀法：利用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離（4） 復合沉淀法：在酶液中加入某些物質，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離（5） 選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質分離

31、酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02?0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2?6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩定性較好的酶堿溶液提取PH8?12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質結合牢固或含有較多非極性基團的酶［的分類與類別截留的顆粒大小主要物質過濾介質粗濾>2um酵母*3菌、動植物細胞、固形物濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷微濾0.2—2um細菌、灰塵微濾膜超濾20A—々0.2urn病毒、生物大分子超濾膜反滲透<20A生物小分子、鹽、離子反滲透膜32、層析分離方法層析技術，亦稱色譜技術,它是利用混合物中各組分的物理化學性質的差別（分子大小和形狀、極性、吸附力、親和力、分配系數），使各組分以不同比例分布在兩個相中，其中一個相為固定的（稱為固定相），另一個相則流過此固定相（稱為流動相）并使各組分以不同速度移動，從而達到分離。吸附層析：利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離。分配層析：利用各組分在兩相中的分配系數不同，而使各組分分離。離子交換層析：利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的。凝膠層析：以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質量不同而達到物質分離。親和層析:利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化。層析聚焦:將酶等兩性物質的等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現組分分離33、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負電荷，與蛋白質結合后使蛋白質所帶負電荷大大超過了天然蛋白質原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質間原有電荷的差異。SDS破壞蛋白質氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質構象改變，使蛋白質-SDS復合物形狀近似橢圓形，短軸相同，長軸與蛋白質分子量成正比。因此，蛋白質一SDS復合物在凝膠中的遷移率不受蛋白質原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質分子量）有關。34、 雙水相萃?。ˋTPE）原理、優勢總結萃取原理：聚合物的不相溶性：當兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時，由于相對分子質量較大，分子間的相互排斥作用與混合過程的熵增加相比占主導地位，一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當達到平衡時，即形成分別富含不同聚合物的兩相。這種含有聚合物分子的溶液發生分相的現象稱為聚合物的不相溶性。雙水相的優勢：（1）含水量高（70%--90%），在接近生理環境的體系中進行萃取，不會引起生物活性物質失活或變性；（2）可以直接從含有菌體的發酵液和培養液中提取所需的蛋白質（或者酶），還能不經過破碎直接提取細胞內酶，省略了破碎或過濾等步驟；（3）分相時間短，自然分相時間一般為5min?15min；（4）不存在有機溶劑殘留問題，高聚物一般是不揮發物質，對人體無害；（5）大量雜質可與固體物質一同除去；（6）易于工藝放大和連續操作，與后續提純工序可直接相連接，無需進行特殊處理；（7）操作條件溫和，整個操作過程在常溫常壓下進行；（8）親和雙水相萃取技術可以提高分配系數和萃取的選擇性。35、 超臨界流體（常用CO2）特性、原理特性：超臨界流體物理特性和傳質特性介于液體和氣體之間：密度比氣體大得多，具有和液體同樣的溶解能力；擴散系數接近氣體，黏度大大低于液體的。這種流體兼有氣液兩重性的特點，它既有與氣體相當的高滲透能力和低的粘度，又兼有與液體相近的密度和對許多物質優良的溶解能力。原理：溶質在某溶劑中的溶解度與溶劑的密度呈正相關，SCF也與此類似。因此，通過改變壓力和溫度，改變SCF的密度，便能溶解許多不同類型的物質，達到選擇性地提取各種類型化合物的目的。36、 反膠束萃取優點1）萃取率和反萃取率高。2）分離濃縮同時進行，溶劑可反復利用。3）解決胞內酶在非細胞環境中迅速失活問題。4）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。5）成本低。37、 金屬離子置換修飾定義把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。38、 金屬離子置換修飾的過程酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經過分離純化，除去雜質，獲得具有一定純度的酶液。2.除去原有的金屬離子：在經過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態。3.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結合，除去多余的置換離子，就可以得到經過金屬離子置換后的酶。4.注意：金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結構中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。39、 金屬離子置換修飾作用1.闡明金屬離子對酶催化作用的影響。2.提高酶的催化效率：雜離子型的a-淀粉酶換成鈣離子型，提高活力。3.增強酶的穩定性：Fe-SOD——Mn—SOD,提高穩定性。4.改變酶的動力學性質：最適pH,米氏常數等的改變。40、 大分子結合修飾過程、作用定義：采用水溶性大分子與酶的側鏈基團共價結合，使酶分子的空間構象發生改變，從而改變酶的特性與功能的方法。（應用廣）大分子修飾（共價）的過程：（1）修飾劑的選擇：大分子結合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、環狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。（聚乙二醇是線性分子，具有良好的生物相容性和水溶性，在體內無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產生交聯，因而，它被廣泛用于酶的修飾。）（2）修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應而結合在一起。在使用之前一般需要經過活化，然后才可以與酶分子的某側鏈基團進行反應。（3）修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。（4）分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。41、 酶分子物理修飾：定義:通過各種物理方法使酶分子的空間構象發生某些改變，從而改變酶的催化特性的方法。特點：在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發生某些變化和重排。42、 酶修飾后的性質變化（1）熱穩定性：一般來說，熱穩定性有較大的提高。（2）抗原性：比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。（3）各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩定性。（4）半衰期：一般在體內的半衰期得到有效延長。由于酶分子經修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩定性，從而延長了在體內的半衰期。（5）最適pH：大部分酶經化學修飾后，酶的最適pH發生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環境，在臨床應用上有較大意義。（6）Km的變化：大多數酶經修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經修飾后，Km值變大。43、 氨基酸置換修飾定義、作用定義：將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸置換成另一個氨基酸，從而改變酶的催化特性的修飾方法。作用：1.提高酶的催化效率：酪氨酰-tRNA合成酶，催化效率提高25倍。2.增強酶的穩定性：T4溶菌酶，熱穩定性提高。3.改變酶的專一性：枯草桿菌蛋白酶。修飾后，該酶失去對蛋白質和多肽的水解能力，卻出現了催化硝基苯酯等底物水解的活性。44、 固定化酶定義、優缺點定義：在一定空間內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續進行反應，反應后的酶可回收重復使用；固定化酶優缺點：優點（1）提高酶穩定性；（2）可反復或連續使用，酶的使用效率提高，成本降低；（3）易于和反應產物分開，產物溶液無酶殘留，簡化提純工藝,增加產物收率，提高產物質量；（4）酶反應過程可嚴格控制；（5）較游離酶更適合多酶反應。缺點：（1）固定化時酶活有損失；（2）增加了生產初始成本；（3）只能用于可溶底物且較小分子；（4）與完整菌體相比不適宜于多酶反應；（5）胞內酶需分離。制備原則：（1）維持酶的催化活性及專一性；（2）有利于生產自動化、連續化；（3）應有最小的空間位阻；（4）酶與載體必須結合牢固；（5）應有最大穩定性，載體不與廢物、產物或反應液發生化學反應；（6）成本要低。45、 酶固定化的方法每種方法及優缺點酶的固定化:將酶固定在水不溶性載體上，制備成固定化酶的過程1.吸附法：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。固體吸附劑:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。特點：操作簡單，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價易得，可反復使用;物理吸附結合能力弱，酶與載體結合不牢固易脫落.2.包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中的固定化方法。多孔載體：瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚酰胺、火棉膠等。①凝膠包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中。不適用于底物或產物分子很大的酶類的固定化;天然凝膠：條件溫和，操作簡便，對酶活影響小，強度較差。合成凝膠：強度高，耐溫度、pH值變化強，因需聚合反應而使部分酶變性失活②半透膜包埋法：將酶包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內，制定固定化酶。底物和產物都是小分子物質的酶結合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵（非共價?。┡c酶結合在一起的固定化方法。活力損失少，結合力較弱，條件（pH值和離子強度）改變時，酶易脫落。①離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合。特點：活力損失少；結合力較弱，條件（pH值和離子強度）改變時，酶易脫落。②共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合。特點:結合很牢固，酶可連續使用較長時間；操作復雜，共價結合可能影響酶的空間構象而影響酶的催化活性。交聯法：借助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，制成網狀結構。雙功能試劑:戊二醛、己二胺、雙偶氮苯等。特點:結合牢固，可以長時間使用；因交聯反應激烈，酶分子多個基團被交聯，酶活損失大，顆粒較小，使用不便。5.熱處理：在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體體內。熱穩定性較好的酶的固定化，要嚴格控制加熱及其時間46、 穩定性比游離酶的好，體現在：①對熱的穩定性提高，可以耐受較高的溫度②保存穩定性好，保存時間延長③對蛋白酶的抵抗性增強，不易被蛋白酶水解④對變性劑（如尿素、有機溶劑、鹽酸胍等）的耐受性提高，保留較高酶活⑤對酶抑制劑、對不同pH穩定性提高.47、 固定化酶的特性1、穩定性2、最適溫度3、最適pH4、底物特異性48、 氨基?；福菏澜缟系谝环N工業化生產的固定化酶。葡萄糖異構酶：世界上生產規模最大的固定化酶。49、 固定化原生質體的特點：（1）解除了細胞壁這一擴散障礙，增加細胞膜通透性，利于氧氣和營養物質的傳遞和吸收，也利于胞內物質的分泌，可顯著提高產率。（2）由于有載體的保護，具有較好的操作穩定性和保存穩定性，可反復使用和連續使用較長時間，利于連續化生產。（3）易于和發酵產物分開，利于產品的分離純化，提高產品質量。（4）需要添加滲透壓穩定劑，保持其穩定性。50、 酶的非水相催化的定義及主要內容定義：酶在非水介質中進行的催化作用。主要內容：一、有機介質中的酶催化：適用于底物、產物兩者或其中之一為疏水性物質的酶催化作用。酶在有機介質中由于能夠基本保持其完整的結構和活性中心的空間構象，所以能夠發揮其催化功能。二、氣相介質中的酶催化：適用于底物是氣體或者能夠轉化為氣體的物質的酶催化反應。三、超臨界介質中的酶催化：對酶結構、催化無影響。具有良好化學穩定性，對設備沒腐蝕。臨界溫度不能太高。廉價宜得。四、離子液介質中的酶催化：酶在離子液中的催化作用具有良好的穩定性和區域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點51、 有機介質反應體系種類、各自構成1.微水介質體系（非極性有機溶劑酶懸浮體系）:有機溶劑和微量的水組成的反應體系，是有機介質酶催化中廣泛應用的一種反應體系。用非極性有機溶劑取代所有的大量水，使固體酶懸浮在有機相中。但仍然含有必需的結合水以保持酶的催化活性。2.與水溶性有機溶劑組成的均一體系：水和極性較大的有機溶劑互相混容組成的反應體系。酶、底物和產物都能溶解在這種體系中。極性較大的有機溶劑對酶活性影響大，能用于該體系的酶少。辣根過氧化物酶催化酚類或芳香胺類聚合。3.與水不溶性有機溶劑組成的兩相或多相反應體系：水和疏水性較強的有機溶劑組成的兩相或多相反應體系。游離酶、親水性底物或產物溶于水相，疏水底物或產物溶于有機相。應用不廣泛。4.正膠束體系：在大量水溶液中含有少量與水不相混溶的有機溶劑，加入表面活性劑后形成的水包油的微小液滴。極性頭部向外，與水結合；疏水尾部向內，形成一個非極性的核心。酶在膠束外面（水相），疏水底物或產物在膠束內部，反應在兩相界面。在有機相酶反應中用得最多的是陰離子表面活性劑：AOT，其化學名為丁二酸-2-乙基酯磺酸鈉。5.反膠束體系：在大量與水不相混容的有機溶劑中，含有少量的水溶液，加入表面活性劑后形成的油包水的微小液滴。疏水尾部向外，與非極性的有機溶劑接觸；極性頭部向內，形成一個極性核。酶分子在反膠束內部的水溶液，疏水性底物或產物在反膠束外部，反應在兩相界面。52、 酶在有機介質中的催化特性有哪幾點？（1）底物專一性。在有機介質中，由于酶分子活性中心的結合部位與底物之間的結合狀態發生某些變化，使酶的底物特異性發生改變。（2）對映體選擇性。是酶在對稱的外消旋化合物中識別一種異構體能力大小的指標。立體選擇系數越大，對映體選擇性越強。酶在水溶液中催化的對映體選擇性較強，而在疏水性強的有機介質中較差。（3）區域選擇性。酶能夠選擇底物分子中某一區域的基團優先進行反應。（4）鍵選擇性。在同一底物分子中有2種以上的化學鍵都可以與酶反應，酶對其中一種化學鍵優先進行反應。（5）熱穩定性。許多酶在有機介質中的熱穩定性比在水溶液中更好；且隨著介質中水含量的增加，熱穩定性降低。（6）pH值特性。在有機介質反應中，酶所處的pH環境與酶在凍干或吸附到載體之前所使用的緩沖液PH值相同，這種現象稱為pH印記。53、 有機溶劑對酶催化有何影響。有機溶劑對酶結構與功能的影響：①對酶分子表面結構的影響。有機溶劑結合到酶分子上，改變酶分子結構。②對酶活性中心結合位點的影響。有機溶劑結合到活性中心，與底物競爭結合位點，降低底物結合能力。2.有機溶劑對酶活性的影響。極性較強的有機溶劑，如甲醇，乙醇等，會奪取酶分子的結合水，影響酶分子微環境的水化層，從而降低酶的催化活性，甚至引起酶的變性失活。LgP：極性系數，表示有機溶劑極性強弱（P指溶劑在正辛烷與水兩相分配系數）。極性系數越小，極性越強。LgP<2不適宜。3.有機溶劑對底物和產物分配的影響。有機溶劑與水之間的極性不同，在反應過程中會影響底物和產物的分配，從而影響酶的催化反應。54、 有機介質中酶催化反應的條件及其控制反應類型：合成反應、轉移反應、醇解反應、氨解反應、異構反應、氧化還原反應、裂合反應。主要應控制的條件：（一）酶的選擇：1.酶種類的選擇：脂肪酶、蛋白酶、次黃嘌吟氧化酶、過氧化氫酶，過氧化物酶等。2.酶形式的選擇：①酶粉；②化學修飾酶；③固定化酶：（二）底物的選擇和濃度控制：1.根據酶在有機介質中的底物專一性選擇適宜底物；底物在有機溶劑和必需水層的分配情況.3.高濃度底物抑制作用（三）有機溶劑的選擇：1、有機溶劑疏水性強：底物難于從有機溶劑進入必需水層，酶中心結合的底物濃度低，反應速度下降。2、有機溶劑極性強：奪取酶分子表面結合水，影響酶分子結構；疏水性底物溶解度低，底物濃度降低，反應速度下降。（四）水含量的控制：水含量低，反應速度隨水含量升高而增大；達到最適水含量，反應速度最大；超過最適水含量，反應速度降低。最適水含量與溶劑極性有關；極性增大，最適水含量也增大。（五）溫度控制：微水有機介質中，由于水含量低，酶的熱穩定性增強，最適溫度高于水溶液。（六）pH值控制：酶分子從緩沖液轉到有機質時，pH狀態不變（pH記憶），凍干過程pH狀態有變化。1.凍干之前的保護措施:選擇合適緩沖液；冷凍干燥保護劑（蔗糖，甘露醇）2.保證最佳解離狀態：凍干之前或催化過程采取保護措施，如凍干之前緩沖液加冠醚（a-胰蛋白酶活力提高426倍）3.有機相緩沖液（七）離子強度55、 手性藥物兩種對映體的藥理作用；手性化合物：是指化學組成相同，而其立體結構互為對映體的兩種異構體化合物。類型：（1）一種對映體有顯著療效，另一種對映體療效很弱或者沒有療效。如，萘普生（S比R高28倍）（2）一種對映體有療效，另一種卻有不良反應。如，反應停（S鎮靜，R致畸）（3）兩種對映體療效相反。如，5-（二甲丁基）-5-乙基巴比妥（左旋鎮靜，右旋興奮）4）兩種對映體具有各自不同的療效。如喘速寧（S擴張支氣管,R抑制血小板凝集）（5）兩種對映體作用互補。如,心得安（S阻斷8受體,R抑制鈉離子通道）56、 酶反應器的類型及優缺點一、攪拌罐型：①分批攪拌罐式反應器，適用的酶：游離酶、固定化酶。優點是：設備簡單，操作容易，酶與底物混合較均勻，傳質阻力較小，反應比較完全，反應條件容易調節控制。缺點是：游離酶難以回收；固定化酶經反復回收使用時，易失去活性，故在工業生產中，間歇式酶反應器很少用于固定化酶，但常用于游離酶。②連續攪拌罐式反應器，適用的酶：固定化酶。優點是：結構簡單、操作簡便、反應條件容易調節控制、底物與固定化酶接觸較好、傳質阻力較低、反應器的利用效率較高。缺點是：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損固定化酶顆粒。二、填充床式反應器：適用于：固定化酶。優點是：設備簡單，操作方便，單位體積反應床固定化酶密度大，可以提高酶催化反應速度，因而，填充床反應器是目前工業生