微生物細胞的破碎第1頁，課件共72頁，創作于2023年2月胞內產物，要首先進行細胞破碎，使代謝產物轉入液相中，然后，再進行細胞碎片的分離。

15微生物細胞的破碎第2頁，課件共72頁，創作于2023年2月一、細胞壁的組成和結構細胞破碎的主要阻力來自于細胞壁。第3頁，課件共72頁，創作于2023年2月（一）、細菌的細胞壁幾乎所有細菌的細胞壁都是由堅固骨架肽聚糖組成。

G+細胞壁結構與G-有很大不同。破碎細菌的主要阻力是來自于肽聚糖的網狀結構，其網結構的致密程度和強度取決于肽聚糖上所存在的肽鍵的數量和其交聯的程度，如果交聯程度大，則網結構就致密。第4頁，課件共72頁，創作于2023年2月（二）、酵母菌的細胞壁

主要成分：葡聚糖與甘露聚糖以及蛋白質等，比革蘭氏陽性菌稍厚，面包酵母的細胞壁厚度約為70nm，而且其厚度隨菌齡增加而增加。有可能僅有一部分厚度對酵母細胞壁的剛性和強度起重要作用。第5頁，課件共72頁，創作于2023年2月結構：最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀，中間是一層糖蛋白，再外面是網狀結構的甘露聚糖。破碎阻力主要決定于壁結構交聯的緊密度和壁厚度。第6頁，課件共72頁，創作于2023年2月大多數真菌的細胞壁主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質和脂類。不同的真菌，細胞壁的組成有很大的不同，其中大多數真菌的多糖壁是由幾丁質和葡聚糖構成。真菌細胞壁的強度和聚合物的網狀結構有關，不僅如此，它還含有幾丁質或纖維素的纖維狀結構，所以強度有所提高。（三）、其他真菌的細胞壁第7頁，課件共72頁，創作于2023年2月紅面包霉菌的細胞壁具有同心圓層狀結構，主要存在三種聚合物，葡聚糖，幾丁質以及糖蛋白。第8頁，課件共72頁，創作于2023年2月（四）、細胞壁的結構和細胞破碎破碎時必須克服的主要阻力是網狀結構的共價鍵。

細胞的大小和形狀以及聚合物的交聯程度都是影響破碎難易程度的重要因素。

壁結構不僅取決于遺傳信息也取決于生長環境，真菌的壁結構還隨發酵罐中混合的機械作用而變化。第9頁，課件共72頁，創作于2023年2月雖然通過改變遺傳密碼或環境因素能夠改變細胞壁的結構，但目前沒有足夠資料表明該法能提高對機械破碎的敏感性，也沒有足夠的資料能用來頂測各種微生物對機械破碎的相對阻力。

在用酶法或化學法來溶解細胞壁時，細胞壁的結構和組成顯得特別重要，可用來作為選擇溶菌酶和化學方法的依據。第10頁，課件共72頁，創作于2023年2月二、微生物細胞的破碎技術第11頁，課件共72頁，創作于2023年2月第12頁，課件共72頁，創作于2023年2月（一）、機械方法

優點：處理量大，破碎速度較快。細胞受到由高壓產生的高剪切力，與玻璃珠一起的高速攪拌或超聲波。

第13頁，課件共72頁，創作于2023年2月機械法的缺點:①

、需高能量，產生高溫和高剪切力，易使產品變性失活;需冷卻卻措施。②、就被破碎的有機體或釋放的產物而論，它們是非專一的。③、產生碎片微粒尺寸的大范圍細分布，大量細顆粒給分離帶來了困難。第14頁，課件共72頁，創作于2023年2月A珠磨機(Beadmill)

研磨：將細胞懸液與玻璃珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使細胞破碎。

實驗室設備：Mickle高速組織搗碎機和Braun勻漿器，利用玻璃小珠撞擊微生物細胞而破碎。

主要缺點：溫度迅速升高，需冷卻。另外，較大量的細胞可用膠質磨來處理。第15頁，課件共72頁，創作于2023年2月工業規模：高速珠磨機。圓盤高速旋轉，使細胞懸液和玻璃珠相互攪動，細胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動而引起。第16頁，課件共72頁，創作于2023年2月

瑞士：DynoMill。

磨室具夾套，可冷卻。在料液的出口處有一旋轉的圓盤和出口平板(出口位于平板的中部)很靠近，可防止珠體隨料液帶出。

典型的珠磨機的構造：第17頁，課件共72頁，創作于2023年2月除磨室以夾套冷卻外，攪拌軸和圓盤也可以冷卻，圓盤交錯地裝在軸上，一種處于徑向，另一種和軸傾斜，徑向圓盤使磨料沿徑向運動，而傾斜圓盤使產生鈾內運動。這種交錯的運動，提高了破碎效率。西德生產的容量為20L的LM—20型珠磨機。第18頁，課件共72頁，創作于2023年2月

破碎作用是相對于時間的一級反應速度過程，符合下列公式：破碎作用動力學第19頁，課件共72頁，創作于2023年2月影響速度常數K的因素：

珠體直徑，細胞濃度和負荷，料液流速，攪拌器轉速和構型，溫度等。不僅影響破碎程度，也影響所需能量。

第20頁，課件共72頁，創作于2023年2月珠體的大小應根據細胞大小、濃度以及在連續流動的操作過程中不使珠體帶出來選擇，珠體在磨室中的裝量影響破碎程度和所需能量。增加攪拌速度能提高破碎效率，但過高會使破碎率降低，能耗增大。

操作溫度在5—40℃范圍內對破碎物影響較小，但操作過程中，磨室溫度很容易升高，較小設備可采用冷卻夾套，但大型設備中熱量的除去是必需考慮的一個問題。第21頁，課件共72頁，創作于2023年2月B高壓均質器

大規模破碎細胞常用，利用高壓迫使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環造成細胞破碎。第22頁，課件共72頁，創作于2023年2月對酵母菌等難破碎的及濃度高或處于靜止期的細胞，常采用多次循環。其破碎屬于一級反應速度過程，被破碎的細胞分率符合下式公式：多次循環第23頁，課件共72頁，創作于2023年2月影響破碎的主要因素：壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數。壓力：升高壓力有利于破碎，Brokman研究了能適應于高壓操作的勻漿器，試驗表明在約175MPa的壓力下，破碎率可達100％，但是也有試驗表明當壓力超過一定的值后，破碎率增長得很慢。工業上常采用55—70MPa。第24頁，課件共72頁，創作于2023年2月

破碎性能隨菌體種類和生長環境的不同而不同。

Gray報導生長在簡單的合成培養基上的大腸桿菌比生長在復合培養基上易破碎。

高壓勻漿器中閥門的設計也影響破碎，閥座呈刀口狀比平面閥座破碎效率高。第25頁，課件共72頁，創作于2023年2月第26頁，課件共72頁，創作于2023年2月C.X-Press法原理：

將濃縮的菌體懸浮液冷卻至－25℃至－30℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，冷凍細胞從高壓閥小孔中擠出。細胞破碎是由于冰晶體的磨損，包埋在冰中的微生物的變形所引起的。此法稱為X—Press法或Hughespress法，主要用于實驗室中。第27頁，課件共72頁，創作于2023年2月影響因素：

高濃度的細胞、低溫、高的平均壓力能促進破碎。優缺點：

適用范圍廣，破碎率高，細胞碎片的粉碎程度低、活性保留率高，但是，該法對冷凍—融解敏感的生化物質不適用。第28頁，課件共72頁，創作于2023年2月頻率超過15-20kHz的超聲波可使懸浮液中微生物細胞失活，在較高的輸人功率下，可破碎微生物細胞。實驗表明，在聲能高達200聲瓦的20kHz聲頻下，經超聲波處理的釀酒酵母的蛋白質釋放量在細胞濃度達到600kg(濕重)/m3之前，與細胞濃度無關，而幾乎與輸入聲能成正比。D.超聲波法第29頁，課件共72頁，創作于2023年2月

原理：

破碎原理是超聲波的空穴作用。在相當高的輸入聲能下，液體各個成核部位會形成許多小氣泡。在聲波膨脹相中，這些氣泡會增大，而在壓縮相中氣泡會被壓縮，直到不能再壓縮時，氣泡破裂，釋放出猛烈的震波。這種震波通過介質傳播。在氣泡發生空穴現象的破碎期間，大量聲能被轉化成彈性波形式的機械能，引起局部的剪切梯度使細胞破碎。液體對聲能的吸收是由總的壓力決定的，在達到某一限值之前，提高環境壓力可以提高聲能對震波能的轉化率。第30頁，課件共72頁，創作于2023年2月缺點：溫度劇烈上升，需冷卻。不適于大規模操作，因為放大后，要輸入很高的能量來提供必要的冷卻。第31頁，課件共72頁，創作于2023年2月不同菌種、超聲波處理的效果不同。

桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌容易破碎，對酵母菌的效果極差。第32頁，課件共72頁，創作于2023年2月超聲波破碎時，影響生物產品收率的因素：1、溫度上升當氣泡破裂時，絕大部分釋放出來的能都以熱的形式為液體所吸收，為了避免高溫，懸浮液應預先冷卻到0－5C，并且還應用冷卻液連續通入容器夾套，即短期的聲波破碎與短期的冷卻交替操作，聲波破碎/冷卻的時間比率稱為“負載因素”。第33頁，課件共72頁，創作于2023年2月2、化學效應超聲處理會引起諸如生成游離基這樣的化學效應，它可能對某些需要的分子帶來破壞性影響，但對破碎細胞毫無影響。可通過添加游離基清除劑如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氫氣預吹細胞懸浮液來緩和。第34頁，課件共72頁，創作于2023年2月由一個帶夾套的燒杯組成，其形狀和尺寸會影響懸浮液的流體動力學。對于剛性細胞可以添加細小的珠粒，產生輔助的研磨效應。超聲波反應器內，有四根內環管，由于聲波振蕩能量會泵送懸浮液循環，用插入進出口管到內部燒杯去的方法，就可以實現連續操作。連續超聲波破碎的實驗室裝置第35頁，課件共72頁，創作于2023年2月影響超聲波破碎效率的參數:(1)、振幅振幅直接與聲能有關，影響蛋白質釋放的比速度k。(2)、細胞懸浮液的粘度粘度影響能耗并會抑制空穴現象。第36頁，課件共72頁，創作于2023年2月(3)、表面張力添加表面活性劑或從細胞中釋放出表面活性物質(如蛋白質)，能顯著地影響聲波破碎效率。因為強烈起泡在氣一液界面上會促使蛋白質變性和空穴清除，特別是應用高的功率時。(4)、被處理懸浮液的體積大體積需要高的聲能引起強烈渦流和大氣泡形成。第37頁，課件共72頁，創作于2023年2月(5)、珠粒的體積和直徑

添加細小的珠粒，玻璃或者鋼制的，不僅對空穴的形成有幫助，而且產生輔助“研磨”效應，從而提高破碎效率。在相同珠粒填充密度下，隨著珠粒直徑的變化，k存在最大值。第38頁，課件共72頁，創作于2023年2月(6)、探頭的形狀和材料

對于一個能級恒定的功率，探頭的振幅與其面積成反比，然而對于小直徑的探頭，聲能限制在較小的區域并且效率低。特別是當懸浮液的體積小的時候，能量在探頭嘴附近被懸浮液吸收，強烈的渦流會變小。對于大的探頭，聲能消耗在大范圍上，結果則使振幅更小。探頭嘴通常用鈦制造，因為鈦具有良好的聲學和機械特性以及對生物活性產物的低毒性。為了維修和替換，通常探頭可以拆卸。除鈦以外，還可使用其他材料如不銹鋼或硬質鋼，但是其聲學和機械特性都不如鈦，破碎速度也大幅度降低。第39頁，課件共72頁，創作于2023年2月(7)、細胞懸浮液的流速在連續操作中，流速取決于細胞在反應器中的停留時間，并影響破碎的總收率。聲波破碎在實驗室廣泛應用，但在工業范圍中還未采用這種方法，因為要向大量細胞懸浮液中通入足夠的能量是很困難的。

第40頁，課件共72頁，創作于2023年2月（二）、非機械方法酶解滲透壓沖擊，凍結和融化熱處理、化學法溶胞第41頁，課件共72頁，創作于2023年2月原理：利用酶反應，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達到破壁目的。

A.酶解法第42頁，課件共72頁，創作于2023年2月優點:產品釋放的選擇性高;抽提的速率和收率高;產品的破壞最少;對pH值和溫度等外界條件要求低;不殘留細胞碎片。缺點：廣泛應用受酶的費用限制。若在超濾反應器中使用可溶性固定化酶可望解決酶的費用問題。第43頁，課件共72頁，創作于2023年2月單一酶不易降解細胞壁，需要選擇適宜的酶及酶反應系統，確定特定的反應條件，并結合其他的處理方法，如輻照、加入高濃度鹽及EDTA，或利用生物因素促使生物對酶解作用敏感等第44頁，課件共72頁，創作于2023年2月如果是酵母細胞的破壁，至少有兩種酶是必需的，即細胞壁－溶解蛋白酶和β(1-3)葡萄糖酶，但是β(1-6)葡萄糖酶，甘露糖酶和甲殼素酶將加速這一溶解過程。對于細菌，糖苷酶、N一乙酞胞壁酰-L一丙氨酸酰胺酶和多肽酶的混合物將加速肽聚糖的溶解。在破碎革蘭氏陰性菌時，為了去除外部雙層脂質需要用表面活性劑進行預處理。第45頁，課件共72頁，創作于2023年2月除上述外，可采用的酶還有其他類型的蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶、核酸酶、透明質酸酶等。第46頁，課件共72頁，創作于2023年2月應用最多，專一地分解肽聚糖的?－1，4糖苷鍵，經溶菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中使細胞破裂。溶菌酶：第47頁，課件共72頁，創作于2023年2月

原理：微生物代謝能產生一種能水解細胞壁上聚合結構的酶，以便使生長過程進行下去。可是，改變微生物的環境可以誘發產生過剩的這種酶或激發產生其它的自溶酶，以達到自溶的目的。影響因素：有溫度、時間、pH緩沖液濃度、細胞代謝途徑等。方法：微生物自溶常采用加熱法或干燥法。B.自溶法第48頁，課件共72頁，創作于2023年2月舉例：1、谷氨酸產生菌，可加入0.028mol／LNa2CO3和0.018mol／LNaHCO3，pH10的緩沖液，使成3％的懸浮液，加熱至70C，保溫攪拌20分鐘，菌體即自溶。2、酵母自溶溫度需在45—50C下保持12—24小時。

第49頁，課件共72頁，創作于2023年2月自溶法在一定程度上能用于工業規模，但是，對不穩定的微生物容易引起所需蛋白質的變性，自溶后的細胞培養液過濾速度也會降低。第50頁，課件共72頁，創作于2023年2月采用抑制細胞壁合成的方法能導致類似于酶解的結果。某些抗生素如青霉素或環絲氨酸，能阻止新細胞壁物質的合成。抑制劑應在發酵過程細胞生長期的后期加入。只有當抑制劑加入后，生物合成和再生還在繼續進行，溶胞的條件才是有利的。這樣在細胞分裂階段存在的細胞壁有缺陷，故能達到溶胞作用。此法費用很貴。C.抑制細胞壁合成第51頁，課件共72頁，創作于2023年2月

原理：滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的介質中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液）達到平衡后，介質被突然稀釋，或者將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞壁的破裂。

D.滲透壓沖擊第52頁，課件共72頁，創作于2023年2月例如，從大腸桿菌中制備親水性酶時，首先將細胞用30mmo1／LTris－HCl緩沖液洗滌。然后，將菌體置于30mmol／LTris－HCl，0.1mmo1／LEDTA,pH7.2的20%蔗糖溶液中攪動，待菌體內外平衡后離心，菌體在4C冷卻后，迅速投入冷水中，劇烈攪拌10分鐘，即有水溶性酶被釋放出來。滲透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是合適的。第53頁，課件共72頁，創作于2023年2月

原理：反復凍結—融化法系將細胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復多次而達到破壁作用。由于冷凍，一方面能使細胞膜的疏水鍵結構破壞，從而增加了細胞的親水性能，另一方面胞內水結晶，使細胞內外溶液濃度變化，引起細胞突然膨脹而破裂。對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。

缺點：但通常破碎率很低，即使反復循環多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質的變性。E.反復凍結—融化第54頁，課件共72頁，創作于2023年2月

原理：干燥法可采用空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等。它使細胞膜滲透性改變，當用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內物質就容易被抽提出來。

空氣干燥主要適用于酵母菌，一般在25—30℃的氣流中吹干，然后用水、緩沖液或其它溶劑抽提。空氣干燥時，部分酵母可能產生自溶，所以較冷凍干燥、噴霧干燥容易抽提。

真空干燥適用于細菌的干燥。F.干燥法第55頁，課件共72頁，創作于2023年2月

冷凍干燥適用于較不穩定的生化物質，將冷凍干燥后的菌體在冷凍條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。

有機溶劑脫水：例如，丙酮等使細胞脫水，即可將菌體懸浮液慢慢倒入10倍體積預冷至－20℃的丙酮中攪拌使之脫水，丙酮除能脫水外，還能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。

缺點：干燥法條件變化較劇烈，容易引起蛋白質或其它組織變性。第56頁，課件共72頁，創作于2023年2月G.化學法處理用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分的方法稱為化學滲透法。例如酸、堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑(如丁醇、丙酮、氯仿等)，都可以改變細胞壁或膜的通透性，從而使內含物有選擇性地滲透出來。第57頁，課件共72頁，創作于2023年2月①、酸堿用來調節溶液的pH值，改變細胞所處的環境，從而改變兩性產物－蛋白質的電荷性質，使蛋白質之間或蛋白質與其他物質之間的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取。第58頁，課件共72頁，創作于2023年2月②有機溶劑常用的是甲苯，它被細胞壁脂質層吸收后會導致胞壁膨脹，最后造成細胞壁的破裂，可處理的菌體有無色桿菌、芽孢桿菌、梭菌、假單胞桿菌等菌體。但甲苯具有致癌性，一般選用具有與細胞壁中脂質類似的溶解度參數的溶劑作為細胞破碎用的溶劑。某些脂溶性溶劑也能作為化學處理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，這些試劑容易引起生化物質破壞，還會帶來分離和回收化學物質的問題。第59頁，課件共72頁，創作于2023年2月③表面活性劑

都是兩性化合物，分子中有一個親水基團和一個疏水基團，在適當的pH值和離子強度下，它們凝集在一起形成微膠束，疏水基團聚集在膠束內部將溶解的脂蛋白包在中心，而親水基團則向外層，這樣使膜的通透性改變或使之溶解，該法特別適用于膜結合的酶的溶解。第60頁，課件共72頁，創作于2023年2月表面活性劑有天然的(如膽酸鹽及磷脂)和合成的(陰離子型如十二烷基磺酸鈉;非離子型如吐溫(Tween)，陽離子型如二乙氨基十六烷基溴)兩類。一般來說離子型的比非離子型更有效，但也容易使蛋白質變性。典型的例子是用表面活性劑Triton(非離子型)，從一種諾卡氏菌中選擇性地提取膽固醇氧化酶。這種表面活性劑比較昂貴并且易污染產物，因此難以大規模應用。第61頁，課件共72頁，創作于2023年2月

舉例：對于胞內的異淀粉酶，可加入0.1％十二烷基硫酸鈉或0.4％TritonX—100于酶液中作為表面活性劑，30℃振蕩30h，異淀粉酶就能較完全地被抽提出來，所得比活性較機械破碎為高。

第62頁，課件共72頁，創作于2023年2月任何破壁方法都有局限性和不足，應根據破壁目的、產物的類型和位置，選用合適的方法，達到選擇性地分步釋放目標產物的要求。其一般原則為:若提取的產物在細胞質內，需用機械破碎法。若在細胞膜附近則可用較溫和的非機械法。若提取的產物與細胞膜或壁相結合時，可采用機械法和化學法相結合的方法，以促進產物溶解度的提高或緩和操作條件，但保持產物的釋放率不變。

總結第63頁，課件共72頁，創作于2023年2月選擇破碎方法要考慮的因素：

細胞的數量，產物對破碎條件(溫度、化學試劑、酶等)的敏感性，破碎程度及破碎速度，希望盡可能采用最溫和的方法。具有大規模應用潛力的生化產品還要選擇適合于放大的破碎技術。

第64頁，課件共72頁，創作于2023年2月①多種破碎方法相結合。即機械方法與非機械方法的結合等，如用細胞壁溶解酶預處理面包酵母，然后高壓勻漿，在95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率可接近100%,而單獨高壓勻漿法破碎率只有32%②與下游過程相結合。必須從后分離過程的整體來考慮破碎操作，即破碎過程要易于細胞碎片的除凈;③與上游過程相結合。細胞的培養過程及其環境條件對細胞的結構及破碎難易有很大影響。④用基因工程的方法對菌種進行