第八章植物胚胎培養(yǎng)第八章植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)是指對植物的胚及胚器官(如子房、胚珠、胚乳等)進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成幼苗或者離體研究植物胚胎發(fā)生機(jī)理的生物技術(shù)。植物胚胎培養(yǎng)為揭示植物胚胎形成機(jī)理、克服植物遠(yuǎn)緣雜交不育、不實(shí)、自交不親和等生殖障礙、擴(kuò)大植物遺傳物質(zhì)交流以及利用胚組織建立植物體細(xì)胞無性系等研究提供了新的途徑和方法。包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)等。種子的結(jié)構(gòu)胚的發(fā)育第一節(jié)離體胚培養(yǎng)第二節(jié)胚珠和子房培養(yǎng)第三節(jié)離體授粉、受精與合子培養(yǎng)第四節(jié)胚乳培養(yǎng)第八章植物胚胎培養(yǎng)第一節(jié)離體胚培養(yǎng)一離體胚培養(yǎng)的概念和發(fā)展1.離體胚培養(yǎng)的概念

離體胚培養(yǎng)(embryoculture)是指從植物種子中分離出胚組織進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。2.離體胚培養(yǎng)的發(fā)展胚胎培養(yǎng)已有近百年的歷史：

1904年，Hanning最早成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的成熟胚，并萌發(fā)形成小苗。

1907年，Stingl發(fā)現(xiàn)幾種禾本科植物的胚乳彼此嫁接時(shí)，胚仍能生長良好，因此認(rèn)為，胚不一定依賴本身的胚乳取得營養(yǎng)。

1925年，Laibach在亞麻屬兩個(gè)種間雜交得到的不萌發(fā)的種子胚取出，進(jìn)行離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)胚能萌發(fā)并能長成植株。這一研究給植物遠(yuǎn)緣雜交提供了一個(gè)啟示：在雜交不親和的情況下，把胚在早期取出培養(yǎng)，有可能使雜交獲得成功。

30年代,Tukey成功地培養(yǎng)了多種果樹的胚胎，并獲得成功。蘭科植物的胚培養(yǎng)成小植株。從40年代開始，離體胚培養(yǎng)在多種植物上獲得了成功，如蘋果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、馬鈴薯、甘藍(lán)與大白菜的種間雜種的胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)及子房與胚珠培養(yǎng)均取得了不同程度的進(jìn)展。二離體胚培養(yǎng)的一般方法離體胚培養(yǎng)包括胚胎發(fā)生過程中不同發(fā)育期的胚，一般可分為成熟胚培養(yǎng)和幼胚培養(yǎng)。1.成熟胚培養(yǎng)

成熟胚是指子葉期后至發(fā)育完全的胚。培養(yǎng)較易成功，在含有大量無機(jī)元素和糖的基本培養(yǎng)基上，就能正常生長成幼苗。將成熟或未成熟種子用70％酒精進(jìn)行幾秒鐘的表面消毒→無菌水沖洗3-4次→無菌條件下進(jìn)行解剖，取出胚并接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)。

培養(yǎng)基：

WhiteTukeyMS

無機(jī)鹽+糖(1-2%)+生長輔助物質(zhì)(激素、氨基酸、活性炭、維生素等)成熟胚培養(yǎng)過程--以玉米成熟胚培養(yǎng)為例1）玉米種子消毒2）在黑暗條件下，將種子放在無菌濕潤的含濾紙的培養(yǎng)皿中培育6hr。3）將吸漲的種子在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)將胚分離出來4）無菌水沖洗3次5）在MS培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)。6）觀察：2d出現(xiàn)胚根，3-4d出現(xiàn)胚芽，10d長成幼苗。玉米成熟胚的培養(yǎng)2.幼胚（未成熟胚）培養(yǎng)：

幼胚是指子葉期以前的幼小胚。

由于幼胚培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交育種上有極大的利用價(jià)值，其研究應(yīng)用越來越深入廣泛。幼胚培養(yǎng)技術(shù)：心形期胚或更早期的胚（長度僅0.1～0.2mm）胚越小就越難培養(yǎng)

幼胚培養(yǎng)成功的有大麥、薺菜、甘蔗、甜菜、胡蘿卜等

（1）未成熟胚胎的培養(yǎng)有三種不同的發(fā)育方式：

a.繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持“胚性生長”；

b.早熟萌發(fā)，即培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗；

c.胚在培養(yǎng)基中發(fā)生細(xì)胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成多個(gè)胚狀體或芽原基。

（2）幼胚培養(yǎng)技術(shù)幼胚培養(yǎng)的操作方法與成熟胚培養(yǎng)方法基本相同，值得注意的是切取幼胚必須在高倍解剖鏡下進(jìn)行，操作時(shí)要細(xì)心，盡量取出完整的胚。

幼胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，是提供幼胚所必需的營養(yǎng)和環(huán)境條件。

通常存在的影響條件如下：

a.培養(yǎng)基

幼胚對培養(yǎng)基要求較高，常用的培養(yǎng)基有Tukey，Nitch、MS，B5培養(yǎng)基；需要較高的蔗糖濃度，以提供較高的滲透壓

b.生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

不同植物的胚培養(yǎng)需要的生長物質(zhì)不同，如IAA可明顯促進(jìn)向日葵胚的生長；IAA，KT的共同作用可促進(jìn)薺菜幼胚的生長；一般認(rèn)為IAA可使胚的長度增加；加入BA可提高胚的生存機(jī)會c.天然提取物的作用

椰乳對胚培養(yǎng)有一定的促進(jìn)作用（番茄胚在含有50%椰乳的培養(yǎng)基中可維持生長）一些瓜類的胚乳提取物能促進(jìn)胚生長的能力d.溫光條件

對于大多數(shù)植物的胚來說，在25-30℃為宜早熟果樹如桃的種胚，必須經(jīng)過一定的低溫春化階段才能正常萌發(fā)生長，而馬鈴薯胚以20℃為好。光照可以促進(jìn)某些植物胚的轉(zhuǎn)綠，利于胚芽生長，而黑暗則利于胚根生長。因此以光暗交替培養(yǎng)較為有利。5.其它條件

胚培養(yǎng)中除要求較高的蔗糖濃度、高滲透壓以外，還要求較高濃度的氨基酸及無機(jī)鹽。

三離體胚培養(yǎng)的應(yīng)用1.胚拯救離體胚培養(yǎng)是遠(yuǎn)緣雜交育種中進(jìn)行雜種胚拯救的有效手段。在遠(yuǎn)緣雜交中，常因胚的發(fā)育不良或胚乳不能正常發(fā)育以及胚與胚乳之間的不協(xié)調(diào)等原因?qū)е码s種不育。如果將這類雜種的胚在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期取出進(jìn)行離體培養(yǎng)，就可以使其繼續(xù)生長，從而獲得雜種后代。2.核果類胚的后熟作用早熟的核果類果實(shí)往往產(chǎn)生沒有生活力的種子，無法得到后代。采用胚的離體培養(yǎng)就可以得到其后代。如中科院植物所利用胚胎培養(yǎng)獲得早熟桃新品種“京早三號”時(shí)，用旱生水蜜×桔旱生進(jìn)行雜交，待果實(shí)長到硬核期采下，在低溫2-5℃處理60天，然后進(jìn)行幼胚培養(yǎng)。3.克服種子休眠

有的植物種子成熟后要休眠2-3年才能萌發(fā)，如果將胚取出后放到人工合成培養(yǎng)基上，幾天內(nèi)就能萌發(fā)，大縮短了育種年限。4.使胚發(fā)育不全的植株獲得大量的后代蘭花、天麻等一些植物在種子成熟時(shí)，種子中包含著未分化的胚，有的胚只有6-7個(gè)細(xì)胞，大多數(shù)不能成活，如把胚分離出來放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，胚就能繼續(xù)生長發(fā)育成正常的植株。

5.用于某些植物雜種胚的繁殖胚培養(yǎng)對于一些具有珠心胚（如柑橘、芒果等）的植物具有特殊的意義。這些植物都存在著珠心胚，可以達(dá)到50多個(gè)以上。在柑橘雜交育種中雜交往往得不到雜種胚，因?yàn)殡s種胚的生活能力比較差，而珠心胚生存能力比較強(qiáng)，其生長抑制了合子胚的生長。這種情況下，必須把雜種胚取出來進(jìn)行離體培養(yǎng)，才能獲得雜種后代。6.用于有關(guān)理論研究用于胚胎發(fā)育過程、影響胚發(fā)育的各種因素、胚乳作用以及相關(guān)代謝、生理等研究。

第二節(jié)胚珠和子房培養(yǎng)有些物種間的雜種胚在發(fā)育到心形期或比這一時(shí)期更早的時(shí)期即可能夭折，而在此之前剝離出來在技術(shù)上是十分困難的。在這種情況下，胚珠培養(yǎng)（OvuleCulture）或者子房培養(yǎng)（OvaryCulture）對于獲得雜種或繁殖就有很大的潛在價(jià)值。授粉后胚珠和子房培養(yǎng)是對植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)植物胚珠或子房離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚珠或子房內(nèi)合子或早期胚胎進(jìn)一步發(fā)育并再生出植株的過程。這一技術(shù)為拯救心形期或心形期以前的胚胎提供了新的途徑。一胚珠培養(yǎng)（一）定義：

胚珠培養(yǎng)（OvuleCulture）是將授粉的子房在無菌條件下解剖后，取胚珠置于培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程。有時(shí)也把胚珠連同胎座一起取下來培養(yǎng)。第二節(jié)胚珠和子房培養(yǎng)柱頭花柱子房花梗花托花組成胚囊卵細(xì)胞株心珠孔反足細(xì)胞珠被胚珠極核

株柄（二）意義：

胚珠培養(yǎng)可以解決象蘭科植物成熟胚較小不易培養(yǎng)的問題。另一方面在未受精的胚珠培養(yǎng)中，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體，用于單倍體育種。

（三）培養(yǎng)技術(shù)：

從花中取出子房→→70%酒精消毒30秒→→無菌水沖洗→→5%次氯酸鈉液中滅菌10分鐘→→無菌水沖洗數(shù)次→→在無菌條件下進(jìn)行解剖→→取出胚珠→→放在培養(yǎng)基上→→培養(yǎng)

基本培養(yǎng)基：用Nistch培養(yǎng)基

MS、N6、B5等培養(yǎng)基也可采用關(guān)鍵：選擇胚的發(fā)育時(shí)期——球形胚期的胚珠較易培養(yǎng)成功（四）發(fā)育方式：未受精胚珠受精胚珠愈傷組織發(fā)育成種子大孢子或卵分化為單倍體植株再生植株1.取材：

開花前1－5天摘下未授粉子房；或授粉后摘下子房。二子房培養(yǎng)（OvaryCulture）2.滅菌：

材料處理(禾谷類植物用70%酒精擦洗幼穗；雙子葉植物花蕾用飽和漂白粉滅菌15分)→→70%酒精浸30秒→→無菌水沖洗→→0.1%升汞15－20分鐘→→無菌水沖洗→→無菌濾紙吸干。3.接種：無菌條件下剝開幼花，夾出子房并接種于培養(yǎng)基（MS、N6等）。4.培養(yǎng)：溫度26℃,相對濕度50-60%，16h散射光。三離體胚珠和子房的發(fā)育離體胚珠和子房的植株再生有兩種途徑：

1.在離體培養(yǎng)條件下，合子胚在胚珠內(nèi)繼續(xù)發(fā)育至成熟，最終成熟胚在胚珠萌發(fā)，形成小植株；如棉花等。

2.離體子房或胚珠內(nèi)的幼胚等組織脫分化，產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)誘導(dǎo)后，愈傷組織形成體細(xì)胞或經(jīng)器官發(fā)生，再形成小植株；如柑橘等。四胚珠和子房培養(yǎng)的應(yīng)用1.克服遠(yuǎn)緣雜交中雜種早亡2.用于試管授粉3.創(chuàng)造雌核發(fā)育的單倍體4.獲得大量的體細(xì)胞胚5.繁育無核植物的珠心苗第三節(jié)離體授粉、受精與合子培養(yǎng)一植物離體授粉、受精與合子培養(yǎng)的概念

植物離體授粉(Pollinationinvitro)指在離體條件下對雌蕊的柱頭、帶胎座的胚珠和單個(gè)胚珠進(jìn)行人工授粉和完成受精并形成種子的過程。

離體受精(Fertilizationinvitro)指游離的植物精細(xì)胞和卵細(xì)胞融合形成合子，進(jìn)一步培養(yǎng)使其形成植株的技術(shù)。植物離體授粉、受精也叫植物試管受精。

合子培養(yǎng)(ZygoteCulture)是指對離體受精的合子或分離的自然受精合子進(jìn)行離體培養(yǎng)，并使其進(jìn)一步發(fā)育成植株的技術(shù)。二離體授粉1.離體授粉的一般方法(1)花粉的收集將要開花的幼穗或花蕾，經(jīng)過常規(guī)消毒后在無菌條件下讓花藥自然開裂，用無菌培養(yǎng)皿或?yàn)V紙收集撒出來的花粉，用于體外授粉。(2)子房或胚珠的剝離在開花前1天將雌穗或花蕾取下，經(jīng)過常規(guī)消毒后在無菌條件下錄取完整子房或胚珠，并及時(shí)轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基。(3)授粉第一種方式：將子房接入培養(yǎng)基，然后用毛筆粘取收集的新鮮花粉，涂在雌蕊的柱頭上。第二種方式：在子房剝離后，可直接用子房的柱頭直接粘取花粉或用毛筆在管外子房柱頭上涂上花粉后再接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。(4)培養(yǎng)一般情況下，試管授粉培養(yǎng)物在黑暗中或散光條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度一般在25-28℃。

2.影響離體授粉的因素親本組織柱頭和花柱雌蕊的生理狀態(tài)Ca2+的作用Ca2+

離子具有刺激花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用授粉方式三植物離體授粉、受精與合子培養(yǎng)的應(yīng)用1.克服遠(yuǎn)緣雜交不育2.克服自交不親和3.在誘導(dǎo)單倍體植株上的應(yīng)用4.用于花粉生理和受精生理的研究第四節(jié)胚乳培養(yǎng)一胚乳培養(yǎng)的概念和發(fā)展胚乳培養(yǎng)(endospermculture)是指分離被子植物的胚乳組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其經(jīng)過脫分化和再分化形成植株的過程。糊粉層

胚乳是由兩個(gè)單倍的極核和一個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的三倍體組織。由它可獲得無子結(jié)實(shí)的三倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成六倍體植株。

胚乳的離體培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)30年代，Lampe和Mills(1933年)進(jìn)行了被子植物胚乳離體培養(yǎng)的最初嘗試，他們培養(yǎng)了玉米未成熟胚乳，發(fā)現(xiàn)靠近胚的胚乳層組織能增殖，雖然沒有培養(yǎng)成功，但指出了胚乳培養(yǎng)的可能性。

LaRue等對胚乳組織在離體培養(yǎng)中的生長和分化進(jìn)行了長達(dá)9年的深入研究，于1949年報(bào)道了玉米未成熟胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，能夠不斷產(chǎn)生愈傷組織，但未分化出器官。

胚乳培養(yǎng)的發(fā)展直到1965年，Johri和Bhojwani在檀香科寄生植物柏形外果的研究中第一次發(fā)現(xiàn)胚乳離體培養(yǎng)可以直接分化出三倍體的植株。這一發(fā)現(xiàn)有力推動了胚乳培養(yǎng)研究的發(fā)展，導(dǎo)致70年代胚乳培養(yǎng)研究的高峰時(shí)期，陸續(xù)有多各植物的胚乳離體培養(yǎng)獲得成功。胚乳培養(yǎng)的發(fā)展1.取材與接種

取授粉4-8d后的幼果→常規(guī)消毒→在無菌條件下切開果實(shí)→取出種子→分離出胚乳→接種

2.培養(yǎng)基

MS、White

2,4-D、NAA（0.5-2.0mg/L）

6-BA0.1-1.0mg/L

二胚乳培養(yǎng)的一般方法培養(yǎng)

在25-27℃和黑暗條件或散射光下培養(yǎng)約6-10d胚乳開始膨大→形成愈傷組織→分化培養(yǎng)基上（附加6-BA0.5-3.0mg/L及少量的NAA）培養(yǎng)→待愈傷組織長出芽后，切下不定芽→生根培養(yǎng)基→光下培養(yǎng)10-15d，切口處可長出白色的不定根。

胚乳培養(yǎng)過程胚乳胚狀體發(fā)育成苗不定芽苗愈傷組織形態(tài)發(fā)生三、影響胚乳培養(yǎng)器官發(fā)生的因素1.胚乳的發(fā)生類型和發(fā)育時(shí)期

處于旺盛生長的胚乳，在離體條件下最容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。

只有當(dāng)胚乳充分發(fā)育到細(xì)胞時(shí)期才能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，而超過一定時(shí)期，就不能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。2.胚在胚乳培養(yǎng)中的作用

胚乳細(xì)胞的脫分化及其進(jìn)一步發(fā)育不一定要有胚的存在，但當(dāng)有胚存在時(shí)，可以明顯提高胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)頻率。3.基因型

研究證明，同一種植物不同品種的胚乳培養(yǎng)難易程度不同，因此材料的基因型對于胚乳培養(yǎng)能否成功非常重要。4.創(chuàng)傷和接種方式

創(chuàng)傷能提高胚乳對培養(yǎng)的反應(yīng)水平。此外，胚乳的接種方式對莖芽分化和分布也有顯著的影響。不論接種方式如何，莖芽總是先在傷口處出現(xiàn)。四、胚乳再生植株的染色體倍數(shù)