DNA分子遺傳標記在中藥中的應用DNA分子遺傳標記

廣義的分子標記（molecularmarker）是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。常用的是狹義的分子標記概念，即DNA分子標記。DNA分子標記主要分為以下三類一、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）：是發(fā)展最早的分子標記技術，以分子雜交為核心技術。二、DNA序列測定2DNA分子遺傳標記在中藥中的應用三、基于PCR的分子標記：根據(jù)引物的選擇可分為隨機引物擴增和特定序列位點擴增。隨機擴增多態(tài)性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。隨機引物擴增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）3DNA分子遺傳標記在中藥中的應用2、DNA擴增產物指紋分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:與RAPD技術不同的是引物濃度更高，長度更短（5～8個bp），只有2個溫度循環(huán)（在RAPD中是3個溫度循環(huán)），一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳。3、特征擴增區(qū)段測序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目標RAPD片段進行測序，根據(jù)RAPD片段兩末端的序列設計特定引物（一般比RAPD引物長，24bp），再進行PCR擴增，可把與原RAPD片段相對應的單一位點鑒定出來，可重復性高。4DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RFLP技術及其應用

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性內切酶切片段長度多態(tài)性)是70年代發(fā)展起來的DNA片段分析技術。該技術不僅在生物學、醫(yī)學、農學的許多領域都有了成功的應用，而且在中藥材品種基源及其地理品系、栽培品系的質量評價方面也有許多應用。5DNA分子遺傳標記在中藥中的應用基本原理

生物在進化過程中，由于種種原因引起基因突變和DNA分子結構重排，造成了分子內核苷酸排列順序的改變，當這種改變涉及到限制性酶切位點時，酶切后產生的DNA片段長度將發(fā)生變化，限制性片段的長度在不同個體間呈多態(tài)性現(xiàn)象，即稱為限制性片段長度多態(tài)(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,簡稱RFLP)6DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes:6-cutterGAATTC 4-cutterTCGACTTAAG AGCT7DNA分子遺傳標記在中藥中的應用8DNA分子遺傳標記在中藥中的應用DNA多態(tài)性根據(jù)其產生的兩種基本方式堿基對突變類型(基因點突變),即限制性內切酶識別位點上發(fā)生了單個堿基替換(轉換或顛換)，使原有切點消失或產生新的切點。結構重排型，這是由DNA內部發(fā)生較大的順序變化所引起的。9DNA分子遺傳標記在中藥中的應用10DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RFLP與鐮狀細胞貧血11DNA分子遺傳標記在中藥中的應用基本實驗步驟靶DNA的準備核酸探針的標記雜交顯示12DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RFLP的優(yōu)點及局限性

優(yōu)點：(1)普遍存在(2)穩(wěn)定性(3)共顯性(4)探針與限制酶的組合數(shù)量無限局限性：（1）用RFLP僅能檢測出影響到限制性內切酶識別位點的突變（2）步驟多，工作量大，而且接觸的放射性污染也多（3）RFLP分析技術要求DNA無顯著降解，因此只適用于新鮮的材料，難適用于干燥藥材的鑒別（4）限制性內切酶價格較貴

13DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RFLP用于親緣關系分析“Ladder”14DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RFLP在中藥材鑒別中的應用

（一）近緣種的鑒別如：海馬的PCR-RFLP分析

（二）藥用植物親緣關系的研究如：羽扇豆屬植物系統(tǒng)發(fā)育關系及與生物堿分布的關系

15DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RAPD技術及其應用

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)技術是1990年由杜邦公司Williams和Welsh兩個研究小組同時發(fā)展起來的一項DNA多態(tài)檢測技術。該技術高效、靈敏、簡便、快速，一經出現(xiàn)就被普遍用于物種種屬分類、親緣關系分析、物種起源鑒定、目的基因篩選、農作物育種等研究領域。近年，RAPD技術又進入了中藥材的鑒別研究領域，并得到廣泛應用，已成為目前用于中藥材鑒定報道最多的分子遺傳標記技術。16DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RAPD技術基本原理RAPD的核心技術是PCR反應，但又不同于經典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸為引物進行PCR擴增，Williams稱之為RAPD，引物通常為10個堿基；Welsh稱之為AP-PCR(ArbitraryPrimerPCR)，引物為20～30個堿基。對于任一引物，如在一定范圍內模板DNA上有與之互補的反向重復序列時，就可擴增出此范圍的DNA片段。17DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA18DNA分子遺傳標記在中藥中的應用基本實驗步驟

模板DNA的制備PCR擴增，通常RAPD擴增條件為：93℃預變性200s，開始如下循環(huán)：94℃變性lmin，36℃退火1min，72℃延伸2min；經過40個循環(huán)后，72℃延伸5min，循環(huán)結束后反應產物置于4℃保存。擴增產物20μl反應產物走凝膠電泳，經溴化乙錠染色檢測擴增的情況RAPD圖譜的數(shù)據(jù)處理19DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RAPD分析的優(yōu)越性和不足優(yōu)越性：(1)無需預知被研究的生物基因組核苷酸順序，也無需專門設計RAPD擴增反應的引物，引物隨機合成或是任意選定的,長度一般為9-10個寡核苷酸；(2)擴增沒有特異性；(3)退火溫度較低，一般為36℃，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對，同時也允許了適當?shù)腻e誤配對，以擴大引物在基因組DNA中配對的隨機性。(4)簡便易行，省力省時。（5）檢測靈敏方便；（6）所需樣品DNA量極少，僅為10ng,為RFLP的1/l000～l/2000。（7）能自動化。20DNA分子遺傳標記在中藥中的應用不足：（1）重復性不高。RAPD在擴增反應時使用的是低溫復性(通常為36℃),特異性不高,引物與模板間有較高的錯配率,結果容易受到多種因素的影響,不同的實驗室這間有時不能重復；（2）對模板DNA質量要求高，操作要求嚴格，檢驗成本相對較高；（3）由于存在共遷移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一條帶中可能含有不同的擴增產物；（4）RAPD標記難以區(qū)分開雜合子和純合子基因型，不能有效的鑒定出雜合子。21DNA分子遺傳標記在中藥中的應用M12345678910111213141516不同Mg2+和dNTP濃度對RAPD帶型的影響22DNA分子遺傳標記在中藥中的應用123456789101112M不同Taq和Primer濃度對RAPD帶型的影響23DNA分子遺傳標記在中藥中的應用M12345678910111213

M13141516171819202122232425不同循環(huán)量和模板DNA濃度對RAPD帶型的影響24DNA分子遺傳標記在中藥中的應用

M123456CK789101112

不同復性溫度對RAPD帶型的影響25DNA分子遺傳標記在中藥中的應用圖4不同復性溫度對RAPD帶型的影響Fig4EffectonRAPDprofilesindifferentannealingtemperature

M123456CK789101112

不同復性溫度對RAPD帶型的影響26DNA分子遺傳標記在中藥中的應用RAPD分析在中藥研究中的應用

道地藥材的評價

例：當歸藥材道地性的RAPD分析野生與栽培種及不同農家品種親緣關系分析例：人參及山參RAPD指紋動物藥的鑒定

例：蛇類藥材分子遺傳標記鑒別的研究27DNA分子遺傳標記在中藥中的應用AFLP技術及其應用

擴增酶切片段多態(tài)性(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)是一種基于PCR的DNA指紋技術，AFLP是近幾年來繼RFLP、RAPD之后發(fā)展最快的DNA分子標記技術。被譽為新一代的分子標記技術，近年來已得到廣泛的應用。28DNA分子遺傳標記在中藥中的應用AFLP基本原理

AFLP的基本原理是對基因組DNA限制性酶切片段進行選擇性擴增。先將基因組DNA用限制性酶消化，產生粘性末端。然后使用人工合成的雙鏈接頭（artificialadapter）,與基因組DNA的酶切片段相連接形成擴增反應的模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片段的幾個堿基序列作為引物的結合位點。AFLP反應的結果是主要擴增那些由上述兩種酶共同酶切的片段。29DNA分子遺傳標記在中藥中的應用基本實驗步驟

模板的制備：即DNA酶切及人工接頭的連接（RestrictionoftheDNAandligationofoligonucleotideadapters）限制性片段的選擇性擴增（Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments）擴增產物凝膠電泳分析（Gelanalysisoftheamplifiedfragments）30DNA分子遺傳標記在中藥中的應用AFLP的實驗過程31DNA分子遺傳標記在中藥中的應用AFLP反應流程：AFLP反應程序主要包括模板DNA制備，酶切片段擴增及凝膠電泳分析這3個基本步驟。各步驟具體的過程有：首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個堿基識別位點的限制性內切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。DNA片段的預擴增。在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴增。PCR產物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。

32DNA分子遺傳標記在中藥中的應用為什么用雙酶解?適合PCR擴增的效率與變性膠的分辨率減少PCR擴增的片段,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目使標記單鏈成為可能增加PCR擴增的靈活性增加使用引物的靈活性33DNA分子遺傳標記在中藥中的應用為什么要預擴增?減少選擇性堿基的錯配降低背景噪音34DNA分子遺傳標記在中藥中的應用35DNA分子遺傳標記在中藥中的應用AFLPs36DNA分子遺傳標記在中藥中的應用37DNA分子遺傳標記在中藥中的應用38DNA分子遺傳標記在中藥中的應用熒光標記全自動AFLPForABI377DNASequencerandAFLPKits39DNA分子遺傳標記在中藥中的應用AFLP技術特點擴增效率高，多態(tài)性比例高AFLP標記穩(wěn)定可靠，不受基因組來源和復雜度的影響，沒有種屬特異性AFLP技術較簡便易行，不需要Southern雜交，不需要預先知道DNA的順序信息，對模板濃度的變化不敏感，允許一定程度的共擴增，且只需要極少量的DNA材料AFLP是一項專利技術，受專利權保護，其分析試劑盒價格偏高40DNA分子遺傳標記在中藥中的應用AFLP在分子中藥中的應用AFLP技術可產生豐富而穩(wěn)定的遺傳標記，它可以用于藥用植物遺傳分析的各個方面，如分類、系統(tǒng)發(fā)育、品種鑒別、遺傳圖譜構建及目的基因的定位等例：AFLP法構建人參、西洋參基因組DNA指紋圖譜

42DNA分子遺傳標記在中藥中的應用微衛(wèi)星標記分析（SSR）微衛(wèi)星中重復單位的數(shù)目存在高度變異，這些變異表現(xiàn)為微衛(wèi)星數(shù)目的整倍性變異或重復單位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多個位點的多態(tài)性。如果能夠將這些變異揭示出來，就能發(fā)現(xiàn)不同的SSR在不同的種甚至不同個體間的多態(tài)性。SSR標記又稱為sequencetaggedmicrosatellitesite,簡寫為STMS，是目前最常用的微衛(wèi)星標記之一。由于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側翼序列通常都是保守性較強的單一序列，因而可以將微衛(wèi)星側翼的DNA片段克隆、測序，然后根據(jù)微衛(wèi)星的側翼序列就可以人工合成引物進行PCR擴增，從而將單個微衛(wèi)星位點擴增出來。由于單個微衛(wèi)星位點重復單元在數(shù)量上的變異，個體的擴增產物在長度上的變化就產生長度的多態(tài)性，這一多態(tài)性稱為簡單序列重復長度多態(tài)性(SSLP)，每一擴增位點就代表了這一位點的一對等位基因。由于SSR重復數(shù)目變化很大，所以SSR標記能揭示比RFLP高得多的多態(tài)性。

43DNA分子遺傳標記在中藥中的應用SSR位點標記的優(yōu)點約50%呈多態(tài)性共顯性數(shù)目多且在基因組中均勻分布多數(shù)位點呈選擇中性，符合群體遺傳學了理論技術上適合用PCR分析半自動化，結果可靠部分降解的DNA樣品也可用適合于等位酶變異小的居群水平的研究44DNA分子遺傳標記在中藥中的應用SSR位點標記的缺點可用的位點數(shù)目少設計引物的費用高，耗時長物種專一性在說明群體分化和物種分化時可能產生錯誤45DNA分子遺傳標記在中藥中的應用SSR標記的應用領域遺傳圖譜的構建連鎖分析特殊的基因（如感病基因）姻親分析樣品鑒定（如父本分析、血緣分析、等號樣品分析、雜種分析）物種和居群的遺傳多樣性群體遺傳學分析（如有效群體大小、群體遺傳結構、群體分化、遷移與基因流動）傳粉生物學與散布生物學（如花粉和種子的散布、交配系統(tǒng)）保護生物學46DNA分子遺傳標記在中藥中的應用Comparisonamonggeneticmarkers47DNA分子遺傳標記在中藥中的應用由微衛(wèi)星衍生的微衛(wèi)星標記微衛(wèi)星引物PCR(MP-PCR)也叫單引物擴增RCP(singleamplificationPCR,簡寫為SPAR)該方法是利用單個微衛(wèi)星的人工合成寡核苷酸片段為引物進行PCR擴增。可以想象，如果兩個反向排列的微衛(wèi)星出現(xiàn)于同一可擴增的范圍內，這兩個反向排列的微衛(wèi)星間的序列就可擴增出來，因而該方法稱為微衛(wèi)星引物PCR。用此方法擴增出來的是兩個反向排列的微衛(wèi)星之間的序列，并非微衛(wèi)星位點本身。實踐證明，用該方法對三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重復的微衛(wèi)星位點的擴增效果較好，而對二核苷酸位點重復的擴增效果較差。48DNA分子遺傳標記在中藥中的應用ISSR(Intersimplesequencerepeat)這是Zietkiewitcz等(1994)發(fā)展起來的又一種微衛(wèi)星基礎上的分子標記。與SSR標記相反，該法是直接利用同位素標記的SSR序列為引物，用PCR的方法擴增兩個SSR之間的單拷貝序列。為增加特異性，設計引物時在引物的5′端和3′端分別引入1～2個選擇性堿基，引物長度16～18bp，擴增產物通過放射自顯影顯現(xiàn)，這樣其擴增物就是MP-PCR擴增產物中的一部分，提高了實驗結果的可重復性。ISSR引物的開發(fā)不象SSR引物一樣需測序獲得SSR兩測的單拷貝序列，開發(fā)費用降低。與SSR標記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不象SSR標記一樣具有較強的種特異性；與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標記，已用于遺傳作圖、品種鑒定等研究。

49DNA分子遺傳標記在中藥中的應用DNA測序技術及其應用

DNA測序原理及方法優(yōu)點及不足

優(yōu)點：DNA測序技術重現(xiàn)性好、結果準確清楚，而且可以利用已測物種的DNA序列建立“對照序列”文庫，避免設立對照品。新測定的DNA序列也可加入此對照文庫中，供他人參考