蛋白質的共價結構第1頁，課件共88頁，創作于2023年2月蛋白質（Protein）1838年，J.J.Berzelius提出，由西臘文proteuo衍生而來——第一重要，首要的物質第2頁，課件共88頁，創作于2023年2月蛋白質存在于所有生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質和功能物質。蛋白質是生命活動的物質基礎，參與了幾乎所有的生命活動過程。第3頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質功能的多樣性1.催化功能-酶2.調節功能-激素、基因調控因子3.轉運功能-膜轉運蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、蛋、谷蛋白5.運動功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結構成分-皮、毛、骨、牙、細胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.異常功能第4頁，課件共88頁，創作于2023年2月二、蛋白質通論（一）、蛋白質的化學組成和分類１、元素組成第5頁，課件共88頁，創作于2023年2月第6頁，課件共88頁，創作于2023年2月２、蛋白質的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質的絕大部分。大多數蛋白質含氮量接近于16%

蛋白質含量=每克樣品中含氮的克數6.25凱氏定氮法第7頁，課件共88頁，創作于2023年2月３、蛋白質的分類（1）、依據外形分類球狀蛋白質：globularprotein

纖維狀蛋白質：fibrousprotein

膜蛋白質：membraneprotein

第8頁，課件共88頁，創作于2023年2月（2）、依據蛋白質的組成分類簡單蛋白simpleprotein

單純蛋白，僅由氨基酸組成結合蛋白conjugatedprotein由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成第9頁，課件共88頁，創作于2023年2月簡

單

蛋

白清蛋白和球蛋白albuminandglobulin

廣泛存在于動物組織谷蛋白和醇溶谷蛋白glutelinandprolamin

植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/堿精蛋白和組蛋白堿性蛋白存在于細胞核硬蛋白

第10頁，課件共88頁，創作于2023年2月結

合

蛋

白色蛋白：簡單蛋白+色素物質糖蛋白：簡單蛋白+糖類物質脂蛋白：簡單蛋白+脂類結合核蛋白：簡單蛋白+核酸第11頁，課件共88頁，創作于2023年2月N端C端按照蛋白質的多肽鏈的組成分類有些蛋白質是由兩條或多條多肽鏈構成,這樣的蛋白質稱為寡聚蛋白質或者多聚蛋白質,其中每條多肽鏈稱為亞基.如:血紅蛋白.有些蛋白質僅由一條多肽鏈構成,稱為單體蛋白質,如溶菌酶.第12頁，課件共88頁，創作于2023年2月（二）、蛋白質的大小與分子量蛋白質是分子量很大的生物分子對任一種給定的蛋白質，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長度方面都應是相同的，即所謂均一的蛋白質。第13頁，課件共88頁，創作于2023年2月

蛋白質與多肽無嚴格的界線——通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質。蛋白質分子量變化范圍很大

對于不含輔基的蛋白質,用分子量除于氨基酸殘基的平均分子量110,即可以粗略估計該蛋白質中氨基酸殘基的數目第14頁，課件共88頁，創作于2023年2月蛋白質的分子結構包括

一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)（三）蛋白質構象和結構的組織層次第15頁，課件共88頁，創作于2023年2月定義蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。(一)、蛋白質的一級結構(Primarystructure）主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。（三）蛋白質構象和結構的組織層次第16頁，課件共88頁，創作于2023年2月一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。第17頁，課件共88頁，創作于2023年2月(二)蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象

。定義

主要的化學鍵：

氫鍵

（三）蛋白質構象和結構的組織層次第18頁，課件共88頁，創作于2023年2月2.-折疊1.-螺旋第19頁，課件共88頁，創作于2023年2月3.-轉角4.無規卷曲第20頁，課件共88頁，創作于2023年2月三、蛋白質的三級結構疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。（一）定義（三）蛋白質構象和結構的組織層次第21頁，課件共88頁，創作于2023年2月龍蝦素第22頁，課件共88頁，創作于2023年2月木瓜蛋白酶組織蛋白酶第23頁，課件共88頁，創作于2023年2月雞半胱氨酸蛋白酶抑制劑第24頁，課件共88頁，創作于2023年2月亞基之間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質的四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基(subunit)。第25頁，課件共88頁，創作于2023年2月血紅蛋白的四級結構

第26頁，課件共88頁，創作于2023年2月二、肽（peptide）AA-NH2與另一AA-COOH間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。第27頁，課件共88頁，創作于2023年2月+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵第28頁，課件共88頁，創作于2023年2月由兩個AA組成的肽稱為二肽。由多個AA組成的肽則稱為多肽。組成多肽的AA單元稱為氨基酸殘基。第29頁，課件共88頁，創作于2023年2月多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離-氨基的一端：氨基端或N-端含游離-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序是從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第30頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、肽和肽鍵的結構第31頁，課件共88頁，創作于2023年2月①肽鍵中C-N鍵有部分雙鍵性質

——不能自由旋轉②組成肽鍵原子處于同一平面（肽平面）③鍵長及鍵角一定④大多數情況以反式結構存在第32頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）肽單元參與肽鍵的6個原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元

(peptideunit)

。第33頁，課件共88頁，創作于2023年2月共價主鏈

第34頁，課件共88頁，創作于2023年2月（二）、肽的物理化學性質肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。等電點（兩性）。酸堿性質取決于：—α-羧基、α-氨基、側鏈基團的解離

具有雙縮脲反應——Pr特有的反應。第35頁，課件共88頁，創作于2023年2月（三）、天然存在的重要多肽第36頁，課件共88頁，創作于2023年2月第37頁，課件共88頁，創作于2023年2月第38頁，課件共88頁，創作于2023年2月

谷胱甘肽(glutathione,GSH)第39頁，課件共88頁，創作于2023年2月GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+第40頁，課件共88頁，創作于2023年2月三、蛋白質一級結構的測定什么是Pr的一級結構？蛋白質中氨基酸的排列順序。第41頁，課件共88頁，創作于2023年2月第42頁，課件共88頁，創作于2023年2月1.樣品必需純（>97%以上）2.知道蛋白質的分子量3.知道蛋白質由幾個亞基組成4.測定蛋白質的AA組成并根據分子量計算每種AA的個數5.測定水解液中的氨量計算酰胺的含量前提第43頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略(1)測定蛋白質分子中多肽鏈的數目通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。蛋白質一級結構的測定第44頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略(2)

多肽鏈的拆分蛋白質一級結構的測定第45頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體。可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。蛋白質一級結構的測定第46頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略(3)

斷開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，防止重新被氧化。蛋白質一級結構的測定第47頁，課件共88頁，創作于2023年2月第48頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略蛋白質一級結構的測定(4)測定每條多肽鏈的AA組成，并計算出AA成分的分子比

第49頁，課件共88頁，創作于2023年2月第50頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質一級結構的測定第51頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略(7)測定每個肽段的氨基酸順序蛋白質一級結構的測定(8)確定肽段在多肽鏈中的次序利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。第52頁，課件共88頁，創作于2023年2月（一）、蛋白質測序策略(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質一級結構的測定第53頁，課件共88頁，創作于2023年2月兩類多肽鏈末端氨基酸殘基：

N-端氨基酸

C-端氨基酸在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測定第54頁，課件共88頁，創作于2023年2月Sanger法1、末端分析二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件二硝基苯衍生物黃色第55頁，課件共88頁，創作于2023年2月二甲氨基萘磺酰-AA有強熒光，檢測靈敏度高丹磺酰氯（DNS）法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N(DNS-aa)第56頁，課件共88頁，創作于2023年2月④苯異硫氰酸酯（PITC)法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第57頁，課件共88頁，創作于2023年2月—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITC第58頁，課件共88頁，創作于2023年2月肽鏈外切酶:從多肽鏈N-端逐個向里水解根據不同反應時間測出釋放的AA種類和數量，按反應時間和AA殘基釋放量作動力學曲線蛋白質N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶

—水解以Leu殘基為N-末端的肽鍵速度最大。⑤氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N第59頁，課件共88頁，創作于2023年2月肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個水解根據不同反應時間釋放出的AA種類和數量蛋白質C-末端殘基順序。四種羧肽酶：A,B,C和Y；A和B(胰臟)、C(柑桔葉)、Y(面包酵母)∽A:除Pro/Arg/Lys/外所有C-末端AA殘基∽B:只水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵

③羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2C第60頁，課件共88頁，創作于2023年2月（三）、二硫鍵的斷裂鹽酸胍/尿素解離多肽鏈間的非共價力。應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。第61頁，課件共88頁，創作于2023年2月1、酸水解（四）、氨基酸組成的分析2、堿水解第62頁，課件共88頁，創作于2023年2月1、酶解法:內切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化第63頁，課件共88頁，創作于2023年2月R1=Lys（K）和Arg（R）專一性較強，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點胰蛋白酶trypsin第64頁，課件共88頁，創作于2023年2月R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AALeu、Met和His稍慢R2=Pro（抑制）pH8-9肽鏈水解位點糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰AA性質有關:酸性：-/堿性：+第65頁，課件共88頁，創作于2023年2月R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強的AA水解速度較快肽鏈水解位點R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)第66頁，課件共88頁，創作于2023年2月R1和/或R2＝Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度較快R1=Pro（抑制）pH2肽鏈水解位點胃蛋白酶Pepsin第67頁，課件共88頁，創作于2023年2月肽鏈水解位點羧肽酶和氨肽酶第68頁，課件共88頁，創作于2023年2月2、化學裂解法

①溴化氰水解法(Cyanogenbromide)——選擇性地切割由Met羧基形成的肽鍵。（五）、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解第69頁，課件共88頁，創作于2023年2月②NH2OH斷裂：較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵

Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分斷裂

第70頁，課件共88頁，創作于2023年2月3、肽段的分離純化：

凝膠過濾、凝膠電泳和HPLC法第71頁，課件共88頁，創作于2023年2月N-端分析法

特點：能夠不斷重復循環，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。

1、Edman法（六）、肽段氨基酸序列的測定（苯異硫氰酸酯法）Edman于1950年首先提出。第72頁，課件共88頁，創作于2023年2月PITCPTC-肽第73頁，課件共88頁，創作于2023年2月2、氨肽酶法或羧肽酶法3、質譜法（MS）

靈敏度高、所需樣品少、測定速度快第74頁，課件共88頁，創作于2023年2月第75頁，課件共88頁，創作于2023年2月第76頁，課件共88頁，創作于2023年2月第77頁，課件共88頁，創作于2023年2月第78頁，課件共88頁，創作于2023年2月核糖體蛋白質鏈4.根據核苷酸序列的推定法第79頁，課件共88頁，創作于2023年2月（七）、肽