酶的固定化與酶反應器第1頁，課件共85頁，創作于2023年2月提綱§3.1引言§3.2酶的固定化§3.3細胞的固定化§3.4固定化酶與固定化細胞的應用§3.5酶及固定化酶反應器第2頁，課件共85頁，創作于2023年2月第一節引言

酶的應用受到限制的原因

◆穩定性差，在溫度、pH和無機離子等外界等因素的影響下容易變性；◆反應后從反應混合物中回收有活性的酶使其重復利用有困難，這種一次性的使用方式使得生產成本高，且難以連續化；◆酶反應后成為雜質與產物混合在一起，給后續分離帶來困難。

怎樣獲得理想的生物催化劑？20世紀50年代固定化技術正是出于此目的發展起來的第3頁，課件共85頁，創作于2023年2月1953年，德國人采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，經重氮法活化后分別與羧肽酶、淀粉酶等結合制成不容與水的固定化酶60年代后期，固定化技術迅速發展。1969年，日本千煙一郎首次在工業生產規模應用固定化氨基酰化酶生產L-氨基酸；1978年，日本人用固定化枯草桿菌細胞生產α-淀粉酶；1982年，日本首次研究固定化原生質體生產谷氨酸取得進展在我國，華南理工大學在固定化技術方面有些研究。1984年，郭勇等人首次應用固定化細胞生產α-淀粉酶、糖化酶和果膠酶研究；1986年，應用固定化原生質體生產堿性磷酸酶取得成功

(作業：綜述我國固定化酶技術的研究進展及應用概況)

酶固定化技術的發展

第4頁，課件共85頁，創作于2023年2月

固定化酶的定義固定化酶的制備原則酶的固定化方法固定化酶的性質輔酶的固定化第二節酶的固定化第5頁，課件共85頁，創作于2023年2月固定化酶的定義一、基本概念

所謂固定化酶指在一定空間內呈閉鎖狀態存在的酶，能連續地進行反應，反應后的酶可以回收利用。固定化所采用的酶，可以是經提取分離后得到的有一定純度的酶，也可以是結合在菌體(死細胞)或細胞碎片上的酶或酶系。固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。在固定化細胞(活細胞)出現之前，也有人將固定化菌體稱為固定化細胞。第6頁，課件共85頁，創作于2023年2月優點：

①極易將固定化酶與底物、產物分開；②可以在較長時間內進行反復分子化反應和裝柱連續反應；③大多數情況下能提高酶的穩定性；④產物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；⑤酶的使用效率高，成本降低。二、固定化酶與游離酶相比的特點：第7頁，課件共85頁，創作于2023年2月

缺點：

①固定化時酶活力有損失，如交聯的枯草桿菌蛋白酶晶體水解氨基酸酯的活力比可溶性酶低96.4%，然而固定化的脂肪酶合成酶的活力比游離酶增加40倍；②增加了生產的成本，工廠初始投資大；③只能用于可溶性底物，而且適用于小分子底物，對大分子底物不適合；④與完整菌體相比，不適宜于多酶反應，尤其是需要輔助因子反應；⑤胞內酶必須經過酶的分離手續。第8頁，課件共85頁，創作于2023年2月制備固定化酶要遵循幾個基本原則：必須注意維持酶的催化活性及專一性；固定化應該有利于生產自動化、連續化，為此載體必須有一定的機械強度；固定化酶應有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近；酶與載體必須牢固結合，有利于回收、反復利用；應由最大的穩定性，所選載體不與底物、產物反應；成本低，有利于工業使用。固定化酶的制備原則第9頁，課件共85頁，創作于2023年2月

非共價結合法化學結合法

包埋法

逆膠束酶反應系統熱處理法酶的固定化方法第10頁，課件共85頁，創作于2023年2月非共價結合法結晶法

就是使酶結晶從而實現固定化的方法。晶體酶提供了高的酶濃度，對于活力較低的酶來說具有優越性。局限性：不斷的重復循環中，酶會有耗損。物理吸附法

利用固體吸附劑將酶吸附于其表面而使酶固定化的方法。

常用的載體：☆無機載體：多孔玻璃、活性炭、漂白土、硅膠；

☆天然高分子載體：淀粉、膠原蛋白等；☆大孔樹脂優點：酶活性中心不易被破壞和酶的高級結構變化少，酶活力損失少

缺點：酶與載體相互作用弱，酶易脫落第11頁，課件共85頁，創作于2023年2月離子結合法

酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。載體：☆陰離子交換劑：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等☆陽離子交換劑：CM-纖維素

特點：操作簡單，處理條件溫和，酶的高級結構和活性中心的殘基部已被破壞，能得到酶活回收率較高的固定化酶。其吸附量可達50-150mg酶蛋白/g載體

缺點：結合力較弱，酶與載體的結合不牢固，在pH值和離子強度等條件改變時，酶易脫落。第12頁，課件共85頁，創作于2023年2月以固定化氨基酰化酶為例將處理成一OH型的DEAE-葡聚糖凝膠加至含有氨基酰化酶的0.1mol／L的pH.7.0磷酸緩沖液中，于37℃條件下，攪拌5h，氨基酰化酶就可與DEAE-葡聚糖凝膠通過離子鍵結合，制成固定化氨基酰化酶。將處理過的DEAE-葡聚糖凝膠裝進離子交換柱，用氫氧化鈉處理，使之成為OH型，用無離子水沖洗，再用pH7.0的0.1mol／L磷酸緩沖液平衡備用。另將一定量的氨基酰化酶溶于pH7.0的0.1m01／L磷酸緩沖液中配成一定濃度的酶液，在37℃的條件下，讓酶液慢慢流過離子交換柱，就可制備成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰-DL—氨基酸，生產L—氨基酸。第13頁，課件共85頁，創作于2023年2月1.共價結合法

——酶與載體以共價鍵結合的固定化方法

◆酶分子中可以形成共價鍵的基團：氨基、羧基、巰基、羥基、酚羥基和咪唑基等。

◆共價鍵結合法所采用的載體：

天然有機載體：多糖、蛋白質、細胞等；

無機載體：玻璃、陶瓷等；

合成聚合物：聚酯、聚氨、尼龍等

◆載體的活化：借助于某種方法，在載體上引進某一活潑基團。然后此活潑基團再與酶分子上的某一基團反應，形成共價鍵。化學結合法——共價結合法；交聯法第14頁，課件共85頁，創作于2023年2月◆載體的活化方法

纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，可用溴化氫法、活化酯法、環氧化法及三嗪法。

①溴化氫法：能在非常溫和的條件下與酶蛋白的氨基發生反應而普遍使用，用溴化氫活化的瓊脂糖已在實驗室廣泛用于制備固定化酶。ROHOH[ROHNOC]ROOC=NHR-O-C-NH-ER-O-C-NH-ENHROOC=N-E亞胺碳酸酯型異脲型氨基甲酸酯型H2N+E堿性CNBr(一)羥基聚合物亞氨基碳酸酯衍生物第15頁，課件共85頁，創作于2023年2月②三嗪法HClClR-O-R’-ClH2N-EHS-EOH-ER-O-R’-NH-ER-O-R’-S-ER-O-R’-O-ER-OH+RCNNCNCO+三氯-均三嗪ClCNNCNCClClCl第16頁，課件共85頁，創作于2023年2月③活化酯法④環氧化法第17頁，課件共85頁，創作于2023年2月小結對于含羥基的聚合物載體的活化可以采用：溴化氰法、三嗪法、活化酯法和環氧化法活化，其中溴化氰法活化的瓊脂糖已經在實驗室被廣泛用于制備固定化酶。第18頁，課件共85頁，創作于2023年2月（二）多胺載體①重氮法：具有芳香族氨基酸的載體在稀鹽酸和亞硝酸鈉中進行反應，成為重氮鹽化合物，然后與酶發生偶合反應得到固定化酶。酶蛋白中游離的氨基、咪唑基、酚羥基等參與反應。

R-O-CH2NH2+HNO2

R-O-CH2N+N

R-O-CH2N=N-EHCl第19頁，課件共85頁，創作于2023年2月②甘蔗渣或纖維素等多糖類的載體在堿性條件下與β-硫酸酯乙砜基苯胺（SESA）反應，生成對氨基苯磺酰乙基纖維素（ABSE-纖維素），然后再重氮化，與酶偶聯。

優點：采用比較廉價的纖維素作載體，在酶分子與載體間間隔了ABSE基團，這樣偶聯的載體上的酶蛋白分子有較大的擺動自由度，可以減少載體造成的空間位阻。第20頁，課件共85頁，創作于2023年2月（三）羧基載體②疊氮法①酰肼衍生物第21頁，課件共85頁，創作于2023年2月酶與載體結合牢固，一般不會因底物濃度高或存在鹽類等原因而輕易脫落。反應條件苛刻，操作復雜由于共價結合可能引起酶蛋白高級結構的變化，破壞部分活性中心，因此不能達到比活力較高的固定化酶，酶活回收率一般在30%左右，甚至底物的專一性等酶的性質會發生變化◆共價結合法的特點現已有活化載體的商品出售，如商品名為偶聯凝膠（couplinggel）第22頁，課件共85頁，創作于2023年2月2.交聯法

—用雙功能或多功能試劑使酶與酶或微生物細胞和細胞之間交聯的固定化方法。

雙功能試劑：戊二醛、乙二胺、雙偶氮聯苯胺等，其中應用最廣泛的是戊二醛。參與反應的酶蛋白基團：N-末端的α-NH3ε-NH3、酚羥基、咪唑基、巰基等。戊二醛的反應：第23頁，課件共85頁，創作于2023年2月交聯法的特點

制備的固定化酶結合牢固，可以長時間使用。但由于交聯反應條件較激烈。酶分子的多個基團被交聯，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。

將交聯法與吸附法或包埋法聯合使用，以取長補短。例如，將酶先用凝膠包埋后再用戊二醛交聯，或先將酶用硅膠等吸附后再進行交聯等。這種固定化方法稱為雙重固定化法。雙重固定化法已在酶和菌體固定化方面廣泛采用，可制備出酶活性高、機械強度又好的固定化酶或固定化菌體。第24頁，課件共85頁，創作于2023年2月

將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法，又分為網格型和微囊型兩種方法。網格型：將酶或微生物包埋在高分子凝膠細微網格中的稱為網格型包埋法海藻酸鈣凝膠、K-角叉菜膠、瓊脂凝膠等特點：條件溫和，對酶活性影響小，但強度差

合成凝膠：常用載體：天然凝膠：聚丙烯酰胺凝膠、光交聯樹脂、聚乙烯醇等特點：強度高，對溫度、pH耐受性強，但需一定條件才能反應，易引起酶部分失活。

第25頁，課件共85頁，創作于2023年2月以聚丙烯酰胺凝膠為例在含有酶（或細胞）的水溶液中加入一定比例的單體丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）和交聯劑N,N’-甲撐雙丙烯酰胺；在催化劑（二甲氨基丙氰）和引發劑（過硫酸鉀）的作用下低溫（冰浴）聚合，產生的聚合物凝膠便是固定化酶；通過機械方法分散成一定大小的顆粒以供應用。

此法固定量高，可達10-100mg/g單體，是固定化微生物中用得最多的、最有效的方法。第26頁，課件共85頁，創作于2023年2月微囊型：將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。制備微囊型固定化酶的方法：

?界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有機相界面上溶解度極低而形成皮膜將酶包埋的方法。常用的作為膜材料的高聚物有：硝酸纖維素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等。例如：三醋酸纖維能溶于二氯甲烷，但在甲苯溶液中沉淀析出。酶水溶液+含醋酸纖維的二氯甲烷乳濁液，在攪拌的條件下，混入甲苯中，三醋酸纖維便在水相界面沉淀，形成薄膜。第27頁，課件共85頁，創作于2023年2月?界面聚合法：利用親水性單體和疏水性單體在界面發生聚合的原理包埋酶的方法。

例如：酶水溶液與1,6-己二胺水溶液混合，立即在含有Span-85的氯仿-環己烷中分散乳化，加入溶于有機相的癸二酰氯后，便在油水界面上發生聚合反應，形成尼龍膜，將酶包埋。

特點：此法制備的微囊大小能隨乳化劑濃度和乳化時的攪拌速度而自由控制；制備過程所需時間短；但在包埋過程中由于發生化學反應會引起酶失活。第28頁，課件共85頁，創作于2023年2月包埋法的特點?不需要酶蛋白的氨基酸殘基反應，很少改變酶的結構，酶活回收率高；?在包埋時發生化學聚合反應，酶容易失活；?只有水分子可以通過，高分子凝膠的網格擴散，只適用于作用小分子底物和產物的酶。?二級乳化法：酶溶液先在高聚物（常用乙基纖維素、聚苯乙烯等）有機相中分散，乳化液再在水相中分散成次級乳化液，當有機高聚物溶液固化后，每個固體球內包含著酶液。

特點：方法容易，但膜較厚，影響底物的分散。第29頁，課件共85頁，創作于2023年2月逆膠束：表面活性劑等兩性分子在有機相中自發形成聚集體，表面活性劑親水端連接成逆膠束的極性核，而疏水端向外進入有機相中。

酶以逆膠束形式被固定，并在有機相中參與反應。用于逆膠束的表面活性劑：琥珀酸二辛酯磺酸鈉（AOT）；溴代十六烷基三甲銨（TAB）;氯代三辛基甲銨等.主體有機相：環己烷、庚烷、辛烷、硅油等制備方法：將含酶水溶液注入到含表面活性劑的有機相中，然后進行攪拌直到形成透明膠為止。逆膠束酶反應系統第30頁，課件共85頁，創作于2023年2月

將酶細胞在一定溫度下加熱處理,使酶固定在菌體內制得固定化菌體。如，擴大培養的含葡萄糖異構酶的鏈霉素細胞，在60-65℃處理15min即可。此法可與交聯法或其它方法聯用。熱處理法第31頁，課件共85頁，創作于2023年2月固定化方法的優缺點比較特性物理吸附法離子結合法包埋法共價結合法交聯法制備易易易難難結合力中弱強強強酶活力高高高中中底物專一性無變化無無有變化有再生可能可能不可能不可能

不可能固定化費用低低中中高第32頁，課件共85頁，創作于2023年2月固定化后酶活力的變化固定化對酶穩定性的影響固定化酶的最適溫度變化固定化酶的最適pH變化固定化酶米氏常數的變化固定酶的性質第33頁，課件共85頁，創作于2023年2月固定化酶的活力在多數情況下比天然酶小例如：用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30%，而對低分子底物苯酚精氨酸對硝基酰替苯胺的活力保持80%。固定化后酶活力的變化原因①酶空間自由度受到限制；②空間構象會有所變化；③內擴散阻力使底物分子與活性中心接近受阻；④包埋時，大分子底物不能透過膜與酶接觸第34頁，課件共85頁，創作于2023年2月酶固定化的穩定性一般比游離酶的穩定性好主要表現在：●對熱的穩定性提高，可以耐受較高的溫度；●對各種有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高，在尿素、有機溶劑和鹽酸胍等蛋白質變性劑的作用下，仍可保留較高的酶活力等；●對于不同pH、蛋白酶、貯存條件和操作條件、固定化酶的穩定性都有影響。

固定化對酶穩定性的影響第35頁，課件共85頁，創作于2023年2月穩定性提高的原因：

●固定化后酶與載體多點連接，防止酶分子伸展變形；●酶活力釋放緩慢；●抑制酶的自降解。第36頁，課件共85頁，創作于2023年2月

固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，但有些由于采用的固定化方法和所用載體不同，也會發生變化。以氨基酰化酶為例用DEAE-葡聚糖凝膠經離子鍵結合法固定化后，其最適溫度(72℃)比游離酶的最適溫度(60℃)提高12℃；用DEAE-纖維素固定化的，其最適溫度(67℃)比游離酶提高7℃；用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最適溫度卻比游離酶有所降低。固定化酶最適溫度的變化第37頁，課件共85頁，創作于2023年2月

酶經過固體化后，其作用的最適pH值往往會發生一些變化固定化酶最適pH的變化第38頁，課件共85頁，創作于2023年2月●載體的帶電性質

※帶負電荷的載體制備的固定化酶，其最適pH值比游離酶的最適pH值為高（即向堿性一側移動）；

※帶正電荷載體制備的固定化酶的最適pH值比游離酶的最適pH值為低（即向酸性一側移動）；

※不帶電荷的載體制備的固定化酶，其最適pH值一般不改變（有時也會有所改變，但不是由于載體的帶電性質所引起的）。原因:

由于在使用帶負電荷的載體時，載體會吸引反應液中的氫離子（H+←）到其附近，致使固定化酶所處的反應區域的pH值比周圍反應液的pH值低一些,這樣就必須把反應液的pH值提高一些，才能使酶充分發揮其催化功能。第39頁，課件共85頁，創作于2023年2月●酶催化產物的帶電性質

※催化反應的產物為酸性時，固定化酶的最適pH值要比游離酶的最適pH值高一些；

※產物為堿性時，固定化酶的最適pH值要比游離酶的最適pH※產物為中性時，最適pH值一般不改變。原因:由于固定化載體成為擴散障礙，使反應產物向外擴散受到一定的限制所造成的。當反應產物為酸性時，由于擴散受到限制而積累在固定化酶所處的催化區域內，使此區域內的pH值降低，必需提高周圍反應液的pH值，才能達到酶所要求的pH值。為此，固定化酶的最適pH值比游離酶要高一些。第40頁，課件共85頁，創作于2023年2月固定化酶的表觀米氏常數Km隨著載體的帶電性能變化，具體表現在：

1.酶結合于電中性載體，由于擴散限制造成Km上升；

2.載體電荷性質與底物相反的，固定化酶Km低于溶液的Km；

3.載體與底物電荷相同的，固定化酶的Km顯著增加；變化受溶液中離子強度的影響：離子強度增加，載體周圍的靜電梯度逐漸減少，Km變化也逐漸縮小至消失。

例如：在低離子濃度下，多聚陰離子衍生物胰蛋白酶復合物對苯甲酰胺酸乙酯的Km比原酶小96.8%，但在高離子濃度下接近原酶的Km

固定化酶米氏常數Km的變化第41頁，課件共85頁，創作于2023年2月輔酶的固定化一、輔酶的定義及分類

有無機和無機輔助因子之分。其中有機輔助因子分為兩類：

一是輔酶（酶間載體），其作用是從某反應向另一反應傳遞物質。它們與酶蛋白結合得比較松散，并且往往能夠通過透析法除去。例如，脫氫酶反應中需要的輔酶I（NADH和NAD+）和輔酶Ⅱ（NADPH和NADP＋）；

二是輔基（酶間傳遞），它們與酶蛋白結合相當緊密，用透析法不易除去，必須經過一定的化學處理才能使之分離。它是酶活性中心的組成部分。例如，過氧化氫酶中的鐵卟啉，黃素酶類中的黃素核苷酸（FMN和FAD）及維生素B6、維生素B12等第42頁，課件共85頁，創作于2023年2月二、輔酶的固定化方法輔基的固定化

首先，應選擇合適的載體.目前使用的載體主要有瓊脂糖，此外還有纖維素、玻璃珠及合成高分子載體等。理想的載體應具備的條件：無特異性吸附；具有多孔性；有適合引入配基的官能團；化學穩定性好，；有適當的機械強度。

其次，間隔臂（手臂）的選擇也非常重要。一般輔基分子和載體之間需要0.5～1．0nm長的手臂。此外必須考慮輔基的性質，如疏水性、親水性、離子性和體積大小等因素。

輔基共價偶聯于載體上：①引入適當的功能基團。（一般引入羧基和氨基后），②將具有某種功能團的輔基先與間隔臂結合，再與活化的載體偶聯；或者先使間隔臂與活化的載體結合，再與輔基偶聯。第43頁，課件共85頁，創作于2023年2月與CNBr活化的載體直接偶聯第44頁，課件共85頁，創作于2023年2月與具有間隔臂的載體偶聯第45頁，課件共85頁，創作于2023年2月輔酶的固定化輔酶的固定化方法與酶相似，一般采用溴化氯法、碳二亞胺法以及重氮偶聯法等共價偶聯，亦或將其進行適當的化學修飾后用在超濾器中。共價偶聯法與輔基固定化十分類似。

1.引入功能團和間隔臂

輔酶引入的功能團主要是氨基或羧基。ATP、NAD(P)和CoA的AMP的部分直接體現輔酶活力，所以不適宜進行化學修飾，因此這類酶一般考慮在腺嘌呤6位或8位引入新的功能團，制成輔酶衍生物。

2.高分子化

具有羧基的輔酶衍生物可以用二亞胺的縮合反應使其與具有氨基的聚賴氨酸、聚乙亞胺等水溶性高分子結合而高分子化。水溶性高分子的選擇：①溶解度要大；②分子大小要適當，使其能保持在半透膜中；第46頁，課件共85頁，創作于2023年2月輔酶的再生根據輔酶和酶的固定化情況.需要輔酶的酶反應系統一般分幾種類型:①均不;②輔酶不固定而酶固定;③輔酶固定而酶不固定;④輔酶和酶分別固定;⑤輔酶和酶共固定;⑥輔酶-酶復合物反應系統.NAD+(H)酶HLADH載體骨架NAD+NAD+酶Ⅰ酶ⅡA輔酶和酶共固定在載體上B通過間隔臂將輔助因子直接固定在酶分子上第47頁，課件共85頁，創作于2023年2月一、固定化細胞的定義二、固定化細胞的分類、形態特征三、固定化細胞的制備四、評價固定化酶（細胞）的指標第三節細胞的固定化第48頁，課件共85頁，創作于2023年2月一、固定化細胞的定義

局限性：☆形成不需要的副產物；

☆存在著擴散限制作用；

☆載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性等

固定化細胞是指被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理化學等約束或限制在一定的空間界限內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續使用的活力。

固定化細胞的優越性：

☆固定化細胞密度大，可增殖；☆發酵穩定性好；

☆發酵液中含菌體較少；第49頁，課件共85頁，創作于2023年2月固定化死細胞：在固定化之前或之后細胞經物理或化學方法的處理，目的在于增加細胞膜的滲透性或抑制副反應。固定化靜止細胞和饑餓細胞在固定化之后細胞是活的，但是由于采用了控制措施，細胞并不生長繁殖，而是處于休眠狀態或饑餓狀態。固定化生長細胞又稱固定化增殖細胞，是將活細胞固定在載體上并使其在連續反應過程中保持旺盛的生長、繁殖能力的一種固定化方法。

分類方式固定化細胞細胞類型微生物、動物、植物生理狀態死細胞：完整細胞、細胞碎片、細胞器；活細胞：增值細胞、靜止細胞、饑餓細胞二、固定化細胞的分類、形態特征第50頁，課件共85頁，創作于2023年2月三、固定化細胞的制備

固定化酶和固定化細胞都是以酶的應用為目的，制備方法和應用方法與固定化酶基本相同。

化學法（共價交聯）涉及酶或細胞的化學修飾。由于所用化學藥品的毒性，這類方法可引起細胞破壞。由于在使用中細胞間、細胞和載體間的鍵不易被底物或鹽所破壞，所以操作穩定性高；

吸附螯合法制備固定化細胞條件溫和、方法簡便，但載體和細胞間吸附力弱，操作時細胞易從載體脫落，所以操作穩定性差，但優點是可再生。

包埋法從理論上來說細胞和載體間沒有束縛，固定化后應保持高活力，然而實際上限制酶活力的因素較多。

交聯法沒有良好機械強度，所以不適于實際應用。但可得到高細胞濃度，大多數情況難于再生。第51頁，課件共85頁，創作于2023年2月1.固定化酶（細胞）的活力

☆固定化酶(細胞)活力：催化某一特定化學反應的能力，其大小可用一定條件下所催化的某一反應的初速度表示。

☆固定化酶單位：μmol/min.mg☆表示固定化酶活力時須注明下列測定條件：2.固定化酶（細胞）半衰期

——指在連續測定條件下，固定化酶的活力下降為最初活力一半所經歷的連續工作時間，以t1/2

半衰期t1/2=0.693/KDKD成為衰減常數。

KD=-2.303/t×lg(E/E0)E/E0時間t后沒活力殘留百分數四、評價固定化酶（細胞）的指標

溫度、攪拌速度、固定化酶的干燥條件、固定化的原酶含量、用于固定化的原酶的比活力第52頁，課件共85頁，創作于2023年2月3.偶聯率及相對活力的測定偶聯率=1，表示反應控制好，固定化或擴散限制引起的酶失活不明顯；偶聯率＜1，表示擴散限制對酶活力有影響；偶聯率＞1，表示有細胞分裂或從載體排除抑制劑等原因。偶聯率=加入蛋白質活力-上清液蛋白質活力加入蛋白質的活力X100%相對活力=固定化酶的總活力加入酶的總活力-上清夜中未偶聯酶活力X100%活力回收=固定化酶的總活力加入酶的總活力X100%第53頁，課件共85頁，創作于2023年2月◆生物化學及分子生物學基礎研究?酶的結構與功能研究

●闡明酶反應的機理以糖酵解途徑中，葡萄糖生成3-磷酸甘油醛為例●酶亞基性質的研究

第四節固定化酶與固定化細胞的應用●闡揭示酶原激活機理和研究蛋白質、核酸分子結構

8mol/L尿素透析醛縮酶單亞基固定化第54頁，課件共85頁，創作于2023年2月

新的藥物（包括化學合成藥物、天然藥物及基因工程藥物）的臨床應用不順利，其原因：①易被胃酸破壞或沉淀；②易被肝臟及血液中的酶消除；③細胞毒性藥物選擇性差，副作用大；④親水性強難以穿過細胞膜；⑤藥物穩定性差，不宜貯存。

以上問題不能用簡單的藥物改構來完成，通過從時間和空間分布上控制藥物釋放是一條有效途徑。

幾種重要的控制體系：聚合物修飾、凝膠包埋、微球、免疫導向等。這幾種控釋體系涉及藥物與聚合物載體偶聯或固定于某種聚合物載體上，稱載體藥物。◆藥物控釋載體第55頁，課件共85頁，創作于2023年2月◆生物傳感器

傳感器是能將一種被測量的信號轉換成一種可輸出信號的裝置。生物傳感器（Biosensor）就是利用生物成分作為感受器的傳感器。一般由感受器、換能器和電子線路組成。

感受器是生物傳感器的心臟。制備包括選擇最佳的載體材料和在載體表面固定親和配基。

換能器可以感知固定化配基（分子識別器）與待測物質特異結合產生的微小變化，并把這種變化轉變成其它可以記錄的信號。葡萄糖檢測儀、免疫分析檢測早孕、乙肝和尿糖的試紙第56頁，課件共85頁，創作于2023年2月酶反應器的類型與特點酶反應器的設計與選型酶反應器的操作第五節酶及固定化酶反應器第57頁，課件共85頁，創作于2023年2月按幾何形狀：罐形、塔形、膜式的等；按操作方式：間歇式、連續式；按流體流動特性：理想流動（活塞流）和非理想流動；按酶的類型：均相酶反應器、固定化酶反應器

◆均相酶反應器

1.攪拌罐式反應器

☆組成部分：攪拌器、罐、控溫系統，也可以在反應器內部安裝有擋板，以強化反應過程中物料與酶的混合。一、酶反應器的類型與特點

以酶或固定化酶作為催化劑進行酶促反應的裝置稱為酶反應器（EnzymeReactor）第58頁，課件共85頁，創作于2023年2月第59頁，課件共85頁，創作于2023年2月☆操作方式：分批式：半分批式：☆應用：主要應用于食品和飲料工業中。☆優點：反應器結構簡單，適合于大、中、小型企業。☆缺點：通常不能進行酶的回收，反應結束后，通過加熱的方式使酶變性失活，對于產物的分離、純化有一定的影響。2.超濾膜反應器

☆操作方式：分批操作、連續操作☆膜的形狀：平板狀、管狀、螺旋狀、中空纖維狀☆膜的應用：用于膠態或不溶性底物，尤其是產物對酶有抑制☆缺點：酶的長期操作穩定性差，而且酶易在超濾膜上吸附損失或在膜表面濃縮極化。第60頁，課件共85頁，創作于2023年2月◆固定化酶反應器

1.攪拌罐型反應器（stirredtankreactorSTR）

☆分批式反應器(Batch

stirredtankreactorBSTR)

把固定化酶用于該反應器，每批操作完成后，從流出液中分離出產物和固定化酶，可以采用過濾或離心的方法。由于酶經過反復循環回收，會失去活性，故在工業生產中固定化酶很少采用這種反應器。

☆連續攪拌罐反應器(Continuous

flowstirredtankreactorCSTR)

操作方式采用連續進料、連續出料的方式。

●優點:反應器內的物料可以得到充分的混合，溫度和pH容易控制，傳質阻力少，可以處理粘性物系。●缺點:攪拌槳產生的剪切力較大，容易引起固定化酶的破壞。。第61頁，課件共85頁，創作于2023年2月近年來有一種改良的CSTR，是將載有酶的圓片聚合物固定在攪拌軸上或者放置在與攪拌軸一起轉動的金屬網筐內，這樣既能保證反應液攪拌均勻，又不致損壞固定化酶第62頁，課件共85頁，創作于2023年2月第63頁，課件共85頁，創作于2023年2月2.填充床反應器(Packedbedreactor)

將顆粒狀或片狀固定化酶填充與固定床內，物料按一定的方向以恒定的速度通過反應床。是目前單位體積反應器裝載酶制劑負荷

最高的反應器，也是催化效率較高的反應器。

☆固定化酶的形式:可以采用各種形狀，如球形、碎片、碟形、薄片、丸粒等.

☆載體:有多孔玻璃珠、珠狀離子交換樹脂、聚丙烯酰胺凝膠、二乙胺乙基葡聚糖凝膠、膠原蛋白薄膜片等。近年來，球形微囊體也用于填充床。

☆流型:填充床反應器內流體的流動型態接近于平推流？

（又稱活塞流)流型—理想的無反混反應器底物按照一定的方向以恒定流速通過反應床，即在其橫截面上液體流動速度完全相同。根據底物的流動方式，又有下向流動、上向流動和循環流動。工業生產中，液流方向常用上向方式。第64頁，課件共85頁，創作于2023年2月☆缺點:

●溫度和pH值較難控制;●底物、產物往往會產生軸向濃度分布●床的清洗、更換非常麻煩;

●床內有自壓縮傾向，易堵塞，且運行過程中壓力降很大，增加了運行成本。☆優點:

●可使用高濃度的催化劑，反應產生的產物和抑制物可從反應器中不斷流出；

●產物濃度沿反應器長度逐漸升高，可以減少產物的抑制作用第65頁，課件共85頁，創作于2023年2月3.流化床反應器(FluidizedbedreactorFBR)

是一種裝有較小顆粒的垂直塔式的反應器,底物以一定速度由下向上流過,使固定化顆粒在浮動狀態下進行反應。流體混合程度可認為介于CSTR和PFR之間。

☆優點:●具有良好的混合、傳熱、傳質效果，溫度、pH值的控制比較容易;

●不易堵塞，FBR可用于處理粘性強和含有固體顆粒的底物，也可用于需要供應氣體或排放氣體的反應有;

●可以處理粉末狀底物；

●反應器運行過程中，壓力降較少，即使使用直徑很少的酶顆粒，壓力降也不會很大。

第66頁，課件共85頁，創作于2023年2月☆缺點:●需保持一定的流速運行成本高，難以放大；●酶顆粒處于流動狀態，易受到機械破損;●流化床的空隙體積大，酶濃度不；●由于底物高速流動使酶沖出，降低了轉化率。第67頁，課件共85頁，創作于2023年2月

第68頁，課件共85頁，創作于2023年2月生物流化床是20世紀70年代開發的一種新型生物膜法，美國和日本率先進行了多方面的研究工作并取得了大量的成果。所謂生物流化床就是以砂、活性炭、焦炭等顆粒為載體充填于生物反應器內，因載體表面浮著生長著生物膜而使其密度減小，當污水以一定流速從下往上流動時，載體便處于流化狀態，附著在載體上的生物膜與污水充分接觸而使污水中的有機物得以降解。按照載體流化的動力來源不同，通常可分為以液流為動力的兩相流化床、以氣流為動力的三相流化床和機械攪動流化床等3種類型。一些學者分別利用不同類型的流化床處理啤酒廢水、生活污水和油脂廢水等.第69頁，課件共85頁，創作于2023年2月4.膜型反應器

由膜狀或板狀固定化酶活固定化微生物組裝的反應器均稱為膜型反應器。有(a)平板狀、(b)螺旋卷型、(c)轉盤型、(d)空心酶管和(e)中空纖維膜型

平板型和螺旋卷型反應器具有：①壓力降小；②膜面積清晰③放大容易等優點。缺點：單位體積催化劑的有效面積小。第70頁，課件共85頁，創作于2023年2月空心酶管反應器的酶固定在細管的內壁上，底物溶液流經細管時，只有與管壁接觸的部分進行酶反應。轉盤型固定化酶反應器以包埋法為主，制備成固定化凝膠薄板（圓盤狀或葉片狀）裝配在旋轉軸上，并把整個裝置浸在底物溶液中，此類反應器更換催化劑方便。第71頁，課件共85頁，創作于2023年2月中空纖維膜反應器是數千根醋酸纖維制成的中空纖維（內徑200-500μm，外徑300-900μm）,內層緊密光滑，具有一定分子量截留值，可截留大分子物質而允許不同的小分子物質通過，外層為多孔的海綿狀支持層，酶被固定在海綿狀支持層中。第72頁，課件共85頁，創作于2023年2月5.鼓泡塔型反應器

底物與氣體從底部通入，通常氣體進入反應器前要經過氣體分散板得到充分分散。第73頁，課件共85頁，創作于2023年2月二、酶反應器的設計與選型酶反應器的設計

研究工業酶反應器的主要目的就是追求高的經濟效益，希望酶反應器在時間上、空間上、經濟上達到最佳的效果。

1.酶反應器的設計原理

●底物的酶促反應動力學及溫度、壓力、pH等操作參數對此特性的影響；●反應器的型式和反應器內流體流動狀態及傳熱特性；●需要的生產量及生產工藝流程。三項組合建立操作方程式或設計方程式。

第74頁，課件共85頁，創作于2023年2月2.與設計有關的參數●酶反應器的生產強度:表示每小時每升反應體積所產生的產品的克數。即P:流出液中產物的濃度g/L；Q：流速L/h；VR:反應器體積L或Yp/s:產品轉化率；t：停留時間；S0:流入底物的濃度Qp主要取決于反應器內固定化酶的活性、濃度、酶反應器的特性及操作方法等因素，設計反應器的首要目的是使反應器具有高的Qp第75頁，課件共85頁，創作于2023年2月●產品轉化率Y/p/s反及酶的催化率:

Y/p/s：指每克底物中有多少克轉化為產物，即

Rp/e

表示單位量的酶催化產物形成的克數，即

Sa:單位時間內每克酶能作用

Tc：酶的有效時間，一般以酶的半衰期表示●產物濃度P及底物停留時間tP:是一個影響到分離提純，即回收成本高低的關鍵問題底物在反應器內的停留時間t=VR/q被定義為空時,其倒數1/t稱為空速,又稱稀釋率

第76頁，課件共85頁，創作于2023年2月酶反應器的選擇

1.酶的形狀、大小和機械強度☆反應器的形狀大致可根據酶的形狀來確定

固定化酶的形狀主要有粒狀（顆粒、小球），膜狀（膜、薄膜片狀、管狀）和纖維狀等三種.

粒狀酶:攪拌罐、固定床、流化床反應器等膜狀酶:螺旋式、轉盤式、平板式、空心管膜等膜反應器☆固定化酶的機械強度，希望越大越好

☆溶液酶由于回收困難，一般只適用于BSTR反應器。

2.底物的性質☆溶解性或濁液性底物，對任何類型的反應器都適用☆顆粒狀和膠狀底物，往往會堵塞填充床，需要采用高流速攪拌的

CSTR、FBR以減少底物顆粒的集結、沉積和堵塞，使底物保持懸浮狀態。第77頁，課件共85頁，創作于2023年2月3.酶促反應的動力學特性☆接近平推流特性的填充床反應器，在固定化酶反應器中占有主導地位，適合于產物對酶活性具有抑制作用的反應。

☆若底物表現出對酶的活性有抑制作用時，CSTR所受的影響要比PBR少一些。4.酶的穩定性☆接固定化酶在反應器中催化活性的損失有3種原因：①酶的失效；②酶從載體上脫落；③載體的肢解5.操作要求及運行成本