細胞培養相關問題概述第1頁，課件共69頁，創作于2023年2月1細胞體外培養指從體內組織取出細胞在體外模擬體內環境下，使其生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養技術。細胞培養的培養物可以是單個細胞，也可以是細胞群。第2頁，課件共69頁，創作于2023年2月2細胞體外培養的條件營養成分滲透壓溫度PH氣相無菌無毒的細胞培養環境第3頁，課件共69頁，創作于2023年2月2.1細胞體外生存的營養條件（1）水溶劑、熱穩定性、導熱、表面張力；培養用水電阻率≥1×106Ω。（2）氨基酸20種氨基酸——必須氨基酸、非必須氨基酸；培養基中都含有必須氨基酸；谷氨酰胺——缺乏會引起細胞生長不良甚至死亡；——溶液中不穩定，容易分解。如細胞生長不良，需在培養液中補加谷氨酰胺，終濃度在1~4mmol/L。第4頁，課件共69頁，創作于2023年2月（3）碳水化合物

葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉等。

葡萄糖——主要的能源物質，細胞對葡萄糖的吸收能力最高。

丙酮酸鈉——葡萄糖消耗殆盡時，可替代葡萄糖提供能量。2.1細胞體外生存的營養條件第5頁，課件共69頁，創作于2023年2月（4）無機鹽類細胞生長所必需；維持滲透壓平衡；維持酸堿平衡——磷酸鹽、碳酸鹽等；Ca2+——組織內部細胞之間相互粘連起重要作用；Mg2+——細胞間質重要成分，利于細胞間相互穩定。2.1細胞體外生存的營養條件第6頁，課件共69頁，創作于2023年2月（5）維生素

脂溶性維生素：A、D、E、K；

水溶性維生素：C、B1、B2、B6、B12、生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素等；參與構成各種酶的活性基團成分，參與細胞生存和代謝。（6）促生長因子及激素對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態具有十分重要的作用。如胰島素，它能促進細胞利用葡萄糖和氨基酸；氫化可的松可促進表皮細胞的生長；泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。2.1細胞體外生存的營養條件第7頁，課件共69頁，創作于2023年2月2.2滲透壓細胞必須生活在等滲環境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性；不同動物細胞最適滲透壓不同；人體細胞最適：290mOsm/Kg；鼠細胞最適：320mOsm/Kg；大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260～320mOsm/kg的范圍都適宜。第8頁，課件共69頁，創作于2023年2月2.3溫度最適溫度：35℃～37℃；≤39℃細胞代謝強度與溫度成正比；39～40℃中1h，即會受到損傷，但仍能恢復；41～42℃中1h，細胞會受到嚴重損傷，但不至于全部死亡，部分仍可能恢復；≥43℃時，細胞大多死亡。第9頁，課件共69頁，創作于2023年2月2.3

溫度高于0℃時，低溫只能抑制細胞代謝，并無傷害；25～35℃時，可緩慢生長；4℃放置數小時，在置于37℃，細胞仍能繼續良好生長；冰點以下，溶質損傷、冰晶損傷，細胞死亡。第10頁，課件共69頁，創作于2023年2月2.4

PH每種細胞都有其最適的PH值；大多數細胞適宜7.2～7.4，偏離這一范圍對細胞不利；細胞耐酸性比耐堿性強一些；在偏酸性環境中更有利于細胞生長；有些細胞也喜歡偏堿性環境，如成纖維細胞最適合PH7.4～7.6。第11頁，課件共69頁，創作于2023年2月2.5氣相5%CO2+95%空氣；CO2既是細胞代謝產物，也是細胞所需成分；CO2維持培養基的pH。HCO3-+H+?H2CO3?CO2↑+H2O第12頁，課件共69頁，創作于2023年2月3細胞培養基的概念細胞培養基是人工模擬細胞在體內生長的營養環境，提供細胞營養和促進細胞生長增殖的物質基礎。英文：Medium粉劑——傾向成為“培養基”液體——多稱為“培養液”第13頁，課件共69頁，創作于2023年2月4培養基分類天然培養基合成培養基無血清培養基第14頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.1

天然培養基早期的細胞培養基;直接源于動物組織提取液或體液，如血清、血漿凝塊、淋巴液、胚胎浸出液等;營養價值高;成分復雜、差異大、不穩定、來源受限制;血清使用最廣泛。第15頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.1.1血清的主要成分血液=55%血漿+45%血細胞；血清——去除纖維蛋白（凝血因子）的血漿;成分復雜，大部分已知，少數未知;血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等。第16頁，課件共69頁，創作于2023年2月4..1.2血清的主要作用提供營養物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等；提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素（氫化可的松、地塞米松）、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。提供促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷對培養中的細胞起到某些保護作用：有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，可終止胰酶的消化；血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷；血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如硒等。第17頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.1.3血清的種類牛血清——使用最多人血清馬血清豬血清羊血清雞血清兔血清第18頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.1.4牛血清按照采血時間的早晚來分類的；采血時間越早，營養物質越豐富，所含抗體也越少；由于瘋牛病的原因，到目前為止，我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區進口牛血清，因此市面上的牛血清大多來自澳洲、南美洲，或是國產的。第19頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.1.5牛血清的分類胎牛血清(FBS):fetalbovineserum

直接胚胎心臟取血，胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分最少。新生牛血清(NBS):newborncalfserumornewbovineserum

嚴格：出生24h內寬泛：出生14d內小牛血清（CS)：calfserum

嚴格：出生10d～30d寬泛：出生1y內第20頁，課件共69頁，創作于2023年2月批次間差異較大、成分復雜不利于疫苗和單克隆抗體的生產保存期短（一年）、易污染含細胞毒性成分，抑制細胞生長，如多胺氧化酶、補體、抗體、細菌毒素等價格昂貴、難以保障供應取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，導致實驗失敗或實驗結果不可靠多數細胞不與血清直接接觸，血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態，血清可能促進某些細胞的生長（成纖維細胞），同時抑制另一類細胞生長（表皮細胞）4.1.5牛血清存在的問題第21頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.1.6血清的質量鑒定外觀：土黃色或棕黃色、透明清亮、無沉淀或極少沉淀、比較粘稠；理化性質：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等；

血清中球蛋白主要是抗體，球蛋白含量越低血清質量越高；

血紅蛋白也是越低越好。微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等；促生長效果：克隆形成率、貼瓶率測定法和連續傳代培養法。正常溶血第22頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.1.7血清的貯存與使用（1）貯存

長期——冷凍（≤-15℃）密封、避光；短期——4℃、密封、避光，1m以內。第23頁，課件共69頁，創作于2023年2月（2）解凍2℃~8℃解凍過夜；

室溫下全溶；血清解凍的過程中不時搖勻（勿劇烈）；盡量避免反復凍融和室溫長時間放置；

用量不多時需分裝凍存使用。第24頁，課件共69頁，創作于2023年2月（3）血清的滅活補體(complement)：是存在于正常人和動物血清與組織液中的一組經活化后具有酶活性的蛋白質。不耐熱，可輔助和補充特異性抗體，介導免疫溶菌、溶血作用，故稱為補體。由30余種可溶性蛋白、膜結合性蛋白和補體受體組成的多分子系統（補體系統）細胞毒作用,平滑肌細胞收縮,肥大細胞和血小板釋放組胺,增強吞噬作用,促進淋巴細胞和巨噬細胞發生化學趨化和活化。

第25頁，課件共69頁，創作于2023年2月56℃滅活30min，規則搖晃除非必須，一般不需要滅活滅活會造成血清沉淀物顯著增多，血清的質量下降（3）血清的滅活第26頁，課件共69頁，創作于2023年2月（4）血清使用濃度一般為5%～20%，常用10%，過多血清容易使培養中的細胞發生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，迅速生長之后容易發生惡性轉化。第27頁，課件共69頁，創作于2023年2月（5）血清中的沉淀絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理。經過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長。第28頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.2合成培養基用化學成分明確的試劑配制的培養基組分穩定需添加血清配合使用由于細胞種類和培養條件不同，適宜的培養基也不同，主要包括：BME、MEM、DMEM、RPMI1640、HAMF12等。第29頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.2.1BME(BasalMediumEagle)基礎Eagle培養基（BasalMediumEagle），1955年由Eagle設計，是最簡單的培養基，，BSS＋12種氨基酸＋谷氨酰胺＋8種維生素，最先用于培養小鼠的L細胞和人類HeLa細胞。此基礎上改良的細胞培養基品種有MEM、DMEM、IMDM等。第30頁，課件共69頁，創作于2023年2月是BME的升級版僅含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺和8種維生素氨基酸濃度是BME的兩倍廣泛適應各種已建成細胞系和不同地方的哺乳動物細胞類型的培養4.2.2EMEMorMEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium)第31頁，課件共69頁，創作于2023年2月是Dulbecco改進的MEM氨基酸和維生素的濃度是BME的4倍最先葡萄糖的濃度是1g/L，稱為低糖DMEM后來增加到4.5g/L，稱為高糖DMEM主要用于雜交瘤中骨髓瘤細胞和DNA轉染的轉化細胞的培養高糖更適合高密度細胞培養，適用于附著稍差的腫瘤細胞、克隆培養.4.2.3DMEM(Dulbecco’sModificationofEagle’sMedium)第32頁，課件共69頁，創作于2023年2月McCoy等人在1959年研制是一種專門為培養肉瘤細胞研制的培養基適用于原代細胞、組織活檢細胞和淋巴細胞培養，還適用于較難培養的細胞，如皮膚，牙齦，睪丸，小鼠腎臟，大網膜，腎上腺，肺，脾，大鼠胚胎和其他組織的原代生長，以及活體組織的體外移植。4.2.4McCoy5A第33頁，課件共69頁，創作于2023年2月是McCoy’s5A的改進版含有高濃度的肌醇廣泛用于懸浮細胞的培養，如人類白細胞，骨髓瘤細胞，雜交瘤細胞等血液來源的細胞。4.2.5RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute#1640)第34頁，課件共69頁，創作于2023年2月是DMEM和F12按1:1比例配制而成；神經生物學最常用的基礎培養基；可作為無血清培養基的基礎液；適用于血清含量較低條件下哺乳動物細胞培養。4.2.6DMEM/F12第35頁，課件共69頁，創作于2023年2月是由Iscove改良的Dulbecco培養基較DMEM增加了幾種非必需氨基酸、硒和一些維生素最初用于培養紅細胞和巨噬細胞前體IMDM為營養非常豐富的培養液非常適合于迅速增殖，高密度細胞的培養，包括Jurkat細胞，COS-7，和巨噬細胞IMDM支持小鼠B淋巴細胞，來自骨髓的造血組織，脂多糖刺激的B細胞，T淋巴細胞，和各種雜交細胞的生長也可作為無血清培養的基礎培養基4.2.7IMDM第36頁，課件共69頁，創作于2023年2月1950年由Morgan成功研制；配方復雜，含有核苷酸，核酸等成分；最初用于雞胚肌細胞的培養；還用于各種細胞的維持和病毒生產。4.2.8M199(Medium199)第37頁，課件共69頁，創作于2023年2月含有附加的氨基酸、維生素以及核苷和脂肪酸它可廣泛應用于各種細胞類型包括對營養成分要求苛刻的細胞。4.2.9MEM-Alpha第38頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.2.10Ham’sF10(Ham’sNutrientMixtureF10)由Ham發明，用于人類2倍體細胞和倉鼠細胞的培養。4.2.11Ham’sF12(Ham’sNutrientMixtureF12):F10的升級版，含有更多的維生素、肌醇和氨基酸是為在低血清濃度下克隆CHO細胞而設計的可以在加入很少血清的情況下應用特別適合單細胞培養和克隆化培養是無血清培養中常用的基礎培養液用于培養大鼠，兔子和雞胚細胞，還用于中國倉鼠卵巢細胞以及肺細胞的培養第39頁，課件共69頁，創作于2023年2月采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。適用于快速增殖瘤細胞的培養用于在CO2缺乏的情況下培養腫瘤細胞株4.2.12L-15（LeibovitzMedium）第40頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.2.13其他培養基

Fischer’s細胞培養基：用于白血病微粒細胞培養William’sMediumE：用于大鼠肝上皮細胞的長期細胞培養。MCDB131培養液：用于培養內皮細胞。Opti-MEMIReducedSerumMedia：用于培養造血細胞。植物血凝素（PHA）：增加細胞轉化和DNA合成。第41頁，課件共69頁，創作于2023年2月

4.2.13培養基的保存與運輸干粉：24個月，2～8℃避光保存，室溫運輸。液體：12個月，2～8℃避光保存，不能冷凍，室溫運輸。第42頁，課件共69頁，創作于2023年2月無血清培養基是加入成分明確的血清替代成分，既能滿足細胞的培養要求,又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。細胞功能的精確評估容易進行純化和下游加工性能一致成分明確調節細胞的增殖與分化具有選擇性4.3無血清培養基無血清培養基第43頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.3.1無血清培養基發展歷程基礎培養基+血清無動物源性物質化學組分限定培養基化學組分限定培養基無蛋白培養基無動物源性物質培養基無血清培養基無血清培養基的發展大致經歷了4代，即第一代一般意義上的無血清培養基，第二代無血清無動物衍生蛋白培養基，第三代雙無培養基，以及正在研發中的第四代無血清培養基。第44頁，課件共69頁，創作于2023年2月成分：各種可替代血清功能的生物材料，含大量成分不明的

動植物蛋白。優點：相對于含血清培養基，實驗準確性、可重復性、穩定

性較高。缺點：添加物化學成分不明確，不利于目標蛋白的分離純化。應用：人們根據自己需要對其成分進行一些改進，應用仍較

為廣泛。第一代：一般意義上的無血清培養基第45頁，課件共69頁，創作于2023年2月第二代：無血清無動物衍生蛋白培養基

成分：完全不用動物來源蛋白，蛋白來源于重組蛋白或蛋白

水解物。優點：降低了成本，太高了效率，加快了報批速度。缺點：成分不是十分明確，實驗及生產的穩定性不是很高。應用：主要用于生物藥品的研發和生產。第46頁，課件共69頁，創作于2023年2月第三代：化學組分限定培養基——雙無培養基

成分：完全不含血清、無蛋白或含量極低，所含蛋白是成分

已明。優點：可以保持細胞培養與生產的恒定，目標蛋白分離純化

更容易，成本大大降低，生產管理易控。缺點：但對細胞特異性高，僅用于一種或幾種細胞的培養。應用：用于生命科學研究和基因工程藥物開發第47頁，課件共69頁，創作于2023年2月第四代：研發階段成分：無血清、無蛋白、成分十分明確。優點：可高溫消毒、適合不同細胞生長的全能培養基。應用：廣泛應用于生物和醫學研究，以及工業上產。第48頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.3.2無血清培養基的應用疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品的生產。干細胞的體外培養和研究。腫瘤的研究。從多中細胞混雜的培養中選擇目的細胞。細胞體外分化的研究。激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究。其他第49頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.3.3無血清培養基的組成及其主要補充因子1、無血清培養基主要由兩部分組成：A、基礎培養基：DMEM、MEM、RPIM160、DMEM/F12等。

無血清的基礎培養基一般為所需培養細胞相應的合成培養基，按需要可進行調整。B、血清替代因子：在所有的補充因子中，胰島素、轉鐵蛋白和硒幾乎是所有細胞株在無血清培養基中生長都需要的。第50頁，課件共69頁，創作于2023年2月2、主要補充因子（1）激素和生長因子：多肽類和甾體類激素。多肽類激素：胰島素、生長因子、胰高血糖素等甾體類激素：孕酮、氫化可的松、雌二醇等。多肽類生長因子：表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、神經生長因子等。（2）結合蛋白：轉鐵蛋白、血清白蛋白。（3）貼壁和鋪展因子：纖黏蛋白、層粘蛋白、膠原、多聚賴氨酸、昆布氨酸、血清鋪展因子等。（4）微量元素：主要是硒。第51頁，課件共69頁，創作于2023年2月（5）低相對分子量營養元素:維生素、脂類等。

維生素B、C、E等；丁二胺、亞油酸、α-生育酚等。（6）酶抑制劑：大豆胰酶抑制劑（常用）、牛胰蛋白酶抑制劑等。第52頁，課件共69頁，創作于2023年2月4.4高級培養基（Advancedmedium）濃縮了營養物質和其他成分的培養基只需要<2%的血清(減少50-90%)4.5專用培養基一般為無血清培養基如角質細胞、淋巴細胞、造血細胞、內皮細胞、肝細胞、神經元細胞、胚胎干細胞、CHO細胞、293細胞、各類昆蟲細胞、雜交瘤細胞、羊水細胞等培養基。第53頁，課件共69頁，創作于2023年2月查閱說明書、咨詢供應商；搜索ATCC或中科院細胞庫；查閱文獻；首選MEM做貼壁細胞培養、RPMI1640做懸浮細胞培養；在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。5如何選擇培養基第54頁，課件共69頁，創作于2023年2月5如何選擇培養基第55頁，課件共69頁，創作于2023年2月GlutaMAXL-丙氨酰-L-谷氨酰胺；具有熱穩定性；在水溶液中更穩定，不會自發降解；細胞可逐漸釋放氨肽酶，水解二肽，緩慢釋放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培養基中，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被細胞吸收利用。時效長；效果與添加L-谷氨酰胺相比略有延滯。第56頁，課件共69頁，創作于2023年2月6平衡鹽溶液（BSS）維持滲透壓；緩沖調節溶液的酸堿度；供給細胞能量和無機離子；主要包括PBS、DPBS、Hank’s、DHank’s和Earle等。常用的DPBS和DHank’s：配方中無鈣鎂離子，不會中和胰酶及EDTA活性，用于細胞解離前的清洗、配制試劑。Hank’s、DHank’s：含酚紅、葡萄糖。PH：7.2～7.4第57頁，課件共69頁，創作于2023年2月7消化液7.1胰酶使細胞間結合處蛋白降解，這時細胞由于自身內部細胞骨架的張力作用下成為球形，從而使細胞分開；一般配制成0.1-0.25%濃度；配制時要用不含Ca2+

、Mg2+及血清的平衡鹽溶液；胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定；PH8.0、37℃作用能力最強。第58頁，課件共69頁，創作于2023年2月7.2EDTA破壞細胞間的連接；常與胰酶配合使用；使用濃度為0.02%。第59頁，課件共69頁，創作于2023年2月7.3膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶；作用溫和；不受Ca2+

、Mg2+及血清的抑制；常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%；Ⅰ：用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離；Ⅱ：適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織；Ⅳ：包含至少7種蛋白酶成分，能消化多種組織；Ⅴ：包含至少7種蛋白酶成分，胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。

第60頁，課件共69頁，創作于2023年2月7.4中性蛋白酶中性金屬蛋白水解酶；細胞能保持完整，細胞膜無損；該酶非哺乳動物來源，不含支原體或動物病毒污染；對于溫度、pH的改變、以及血清成分都很穩定；使用螯合劑或稀釋就能簡單滅活；使用濃度0.6-2.4U/ml。第61頁，課件共69頁，創作于2023年2月8抗生素青鏈