基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定第1頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第六章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的

篩選和鑒定第2頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起單酶切、雙酶切第一節(jié)DNA的體外重組DNA的體外重組：將目的基因與載體連接，這種重新組合的DNA稱為重組DNA。第3頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的連接第4頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。②加尾－堿基互補第5頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月④缺點：③優(yōu)點：能把任何片段連接起來操作繁瑣；外源片段難以回收；同聚物尾巴影響外源基因表達。非酶切位點第6頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）銜接物（linker）連接Linker：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的，具有一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別位點的平末端雙鏈寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”第7頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）多核苷酸激酶處理（2）T4連接酶連接（3）限制性內(nèi)切酶消化（4）目的片段與載體連接第8頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）DNA接頭（adapter）連接法①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’第9頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接②優(yōu)點：連上后就能用。③缺點：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。④防止自我連接5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’第10頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’

GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5’HO-GATCCCGG-GGCC

CCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接T4多核苷酸激酶處理使5’磷酸化第11頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點符合載體的多克隆位點；（1）設(shè)計原則（2）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)3’端15～20bp與模板互補；5’端內(nèi)切酶識別序列＋保護堿基避免與所擴增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點重復(fù)。第12頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點請設(shè)計一對PCR引物，在N端和C端分別加一個EcoRI（GAATTC，保護堿基GCA）和BamHI酶切位點（GGATCC，保護堿基CGC），另外，各含有18個同該基因同源的核苷酸，能夠用于擴增該基因的編碼序列。寫出P1和P2的引物序列。第13頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月帶酶切位點的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAGGCGC

PCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位點BamHI位點AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAG

PCR產(chǎn)物-5’3’-GGEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！第14頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA三、PCR產(chǎn)物的連接2.與T載體直接連接第15頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng)噬菌體位點特異性重組系統(tǒng)；

高效的實現(xiàn)DNA序列在多種載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移。入門克隆改造過的各種表達載體第16頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng)（1）創(chuàng)建入門克隆

BP反應(yīng)：attB+attP

attL+attR，產(chǎn)物：入門克隆入門克隆改造過的各種表達載體√第17頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、Gateway載體構(gòu)建系統(tǒng)（2）構(gòu)建表達克隆

LR反應(yīng)：attL+attR

attB+attP，產(chǎn)物：表達克隆入門克隆改造過的各種表達載體√√第18頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（transformation）大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（三）轉(zhuǎn)染（transfection）受體菌直接捕獲噬菌體DNA的過程。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。第19頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）轉(zhuǎn)化（transformation）（1）熱激法（heatshock）（2）電轉(zhuǎn)化法（electronporation）（3）PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（4）接合轉(zhuǎn)化第20頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月制備感受態(tài)細(xì)胞增加受體菌細(xì)胞膜的通透性（1）熱激法①

目的感受態(tài)細(xì)胞：處于能吸收外源DNA分子的生理狀態(tài)的細(xì)胞第21頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月制備感受態(tài)細(xì)胞1、將處于對數(shù)生長期的細(xì)菌置于0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，處于感受態(tài)；2、將感受態(tài)細(xì)胞與DNA混合，Ca2+與DNA結(jié)合形成抗DNase的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面；3、經(jīng)42℃短時間熱激處理，細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物；4、在培養(yǎng)基中生長數(shù)小時之后，球形細(xì)胞復(fù)原并增殖。（1）熱激法②CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA的原理

第22頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月10ng載體DNA100L感受態(tài)細(xì)胞冰浴30min42℃1~2min加入1mLLB培養(yǎng)基（Amp-）37℃振蕩培養(yǎng)1h10-100L轉(zhuǎn)化液涂Amp＋平板吸附DNA攝入DNA操作步驟：（p140）轉(zhuǎn)化率：106-108/gDNA第23頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）電轉(zhuǎn)化法

原理：在高壓脈沖下，細(xì)菌細(xì)胞表面形成暫時性微孔，重組DNA通過微孔進入細(xì)胞后，脈沖結(jié)束，細(xì)胞恢復(fù)原狀。實驗簡單，不需要制備特殊的感受態(tài)細(xì)胞“感受態(tài)”：清洗處理，在低溫下使細(xì)胞處于無離子區(qū)且有甘油或蔗糖等保護劑的懸液中，保證電擊過程中細(xì)胞不被擊穿而死亡。轉(zhuǎn)化率：109~1010/gDNA第24頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第25頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)由噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)的遺傳信息的轉(zhuǎn)移過程（三）轉(zhuǎn)染噬菌體DNA不經(jīng)過蛋白包裝成病毒顆粒，直接被感受態(tài)細(xì)胞捕獲的過程。與轉(zhuǎn)化無本質(zhì)區(qū)別體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，形成噬菌斑。每gDNA能形成106個噬菌斑

現(xiàn)在把DNA轉(zhuǎn)移至動物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染第26頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月

體外包裝過程第27頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞（三）導(dǎo)入動物細(xì)胞第28頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月1.利用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的載體共轉(zhuǎn)化：將兩個以上的基因同時導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞達原生質(zhì)體總數(shù)的1%~2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%~33%第29頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月

酵母0.1mol/LLiCl處理感受態(tài)2.堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化插入外源基因的載體40%PEG4000熱激涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子

吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率：103個

/g

DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少第30頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月4.電擊轉(zhuǎn)化（1）適于原生質(zhì)體和完整細(xì)胞（2）轉(zhuǎn)化率高，105個/gDNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈3.PEG1000轉(zhuǎn)化PEG處理酵母細(xì)胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化第31頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)）DNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞（三）導(dǎo)入動物細(xì)胞第32頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA第33頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌第34頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體第35頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細(xì)胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株第36頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天葉盤法的具體操作第37頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。DNA1.2m鎢彈頭吸附金屬微粒加速，進入受體細(xì)胞基因槍裝入2.基因槍法（genegun）

外植體制備轟擊外植體培養(yǎng)及選擇第38頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第39頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月具體操作1.DNA微彈的制備2.外植體的制備3.DNA微彈轟擊4.外植體的培養(yǎng)第40頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電擊處理愈傷組織幼苗分化3.電擊法（電穿孔法）選擇培養(yǎng)第41頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月二、重組DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法2.脂質(zhì)體介導(dǎo)法3.顯微注射法4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法（二）導(dǎo)入植物細(xì)胞（三）導(dǎo)入動物細(xì)胞第42頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月原理：（三）導(dǎo)入動物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法通過磷酸鈣-DNA共沉淀，將外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。第43頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第44頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月操作簡便，成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對細(xì)胞毒性小、效果穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)染效率低。第45頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月2.脂質(zhì)體介導(dǎo)法脂質(zhì)體包埋DNA，通過細(xì)胞膜進入細(xì)胞。第46頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第47頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月應(yīng)用玻璃顯微注射器，直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。3.顯微注射法1）外源基因制備：線性化的質(zhì)粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后幾小時內(nèi)3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植第48頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第49頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細(xì)胞攝入外源DNA。4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖葡聚糖第50頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月DEAE-dextran外源DNA細(xì)胞混合DEAE-dextran對細(xì)胞有毒，常采用低濃度長時間處理吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分DNA可以進入到細(xì)胞核里。4.DEAE-葡萄糖轉(zhuǎn)染法第51頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月第52頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、轉(zhuǎn)化率及影響因素轉(zhuǎn)化率（cfu

/μgDNA）：每微克重組DNA轉(zhuǎn)化后，接納DNA分子的受體細(xì)胞的個數(shù)，即陽性克隆數(shù)。（一）轉(zhuǎn)化率的計算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/DNA的加入量第53頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、轉(zhuǎn)化率及影響因素例：取1μl（0.1ng/μl）完整的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl的感受態(tài)細(xì)胞。向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900μl培養(yǎng)液，讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時間，取100μl鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落，轉(zhuǎn)化率為多少？轉(zhuǎn)化率＝1000

/0.01ngDNA=108cfu/μg第54頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、轉(zhuǎn)化率及影響因素例：某一DNA重組實驗的重組率為20%，轉(zhuǎn)化率為107cfu/mg天然載體，經(jīng)酶切和連接處理后的重組載體轉(zhuǎn)化率比天然載體約低100倍，欲獲得104個重組克隆，需要投入多少重組載體DNA進行重組實驗？104＝107cfu/mg×10-2×a×20%重組載體a=0.5mg第55頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月三、轉(zhuǎn)化率及影響因素普通的亞克隆實驗：1×106cfu/μgDNA；更復(fù)雜的亞克隆：1×107cfu/μgDNA，如有限量的DNA的轉(zhuǎn)化，T-A克隆；構(gòu)建文庫：>1×108cfu/μgDNA。第56頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月1）載體DNA類型、大小；重組DNA濃度、純度2）受體細(xì)胞3）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法技術(shù)參數(shù)影響轉(zhuǎn)化率（二）轉(zhuǎn)化率的影響因素三、轉(zhuǎn)化率及影響因素第57頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月一、載體表型選擇法二、根據(jù)插入基因的表型選擇三、DNA電泳檢測法四、PCR檢測法五、核酸雜交檢測法六、免疫化學(xué)檢測法七、DNA序列分析第三節(jié)重組子的篩選與鑒定第58頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月1.抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位點BamHI和SalI;Ampr上有插入位點PstI。一、載體表型選擇法第59頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月2.-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍+深藍色第60頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月-半乳糖苷酶使X-gal分解成藍色產(chǎn)物。第61頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進行直接選擇。轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。二、根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長第62頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月例：抗生素抗性抗性基因載體外源DNA連接轉(zhuǎn)化受體菌抗生素培養(yǎng)基平板含抗生素抗性基因的克隆才能生長使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2.增加新性狀第63頁，課件共74頁，創(chuàng)作于2023年2月有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。1.直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。三、DNA電泳檢測法Marker載體重組克隆