天物份司 案肉牛沖胚方案1供體選擇和超數(shù)排卵1.1供體牛的選擇1.1.1供體牛要求健康狀況良好體況中等以上生殖系統(tǒng)和繁殖功能正常，無遺傳和傳染性疾病。1.1.2青年母牛應(yīng)在14個(gè)月齡以上或達(dá)到成年牛體重70以(300~350kg。1.1.3滿。4和。2理素ADE量。2法誘導(dǎo)卵泡波同步發(fā)生方法進(jìn)行超數(shù)排卵處理，即在發(fā)情周期的任意一天放入含孕激素的陰道栓，放置陰道栓4d后(放陰道栓當(dāng)天為0d，開始連續(xù)4d肌肉注射FS（~0g天2隔12h。射FSH后48h肌肉注射PG0.4mg/頭·次，再間隔12h撤栓。注射PG后48h觀察發(fā)情和人工授精（不同F(xiàn)SH用和廠批號(hào)的FSH時(shí)，應(yīng)作超排效果預(yù)試驗(yàn)。）3供體牛的人工授精發(fā)情后12h進(jìn)行第一次輸精每間隔12h再輸精一次每次一支細(xì)管精液，共輸精2~3次。4胚胎采集（采卵）及處理4.1胚胎采集時(shí)間供體發(fā)情后第7d（發(fā)情當(dāng)天為0d）采集胚胎。4.2胚胎采集4.2.1麻醉將供體牛前高后低站立保定后掏凈直腸內(nèi)的宿糞可采用2普魯卡因在薦椎和第一尾椎間隙注射4ml~5m實(shí)施硬膜外腔麻醉其它麻醉劑按說明書使用。1天物份司 案4.2.2外陰清洗、消毒麻醉后將牛尾栓系在牛體一側(cè)用清水沖洗會(huì)陰部和外陰周圍再用0.1%新潔爾滅或0.1高錳酸鉀沖洗消毒用滅菌紙巾擦干最后用酒精棉球擦拭消毒外陰部。4.2.3吸除子宮頸粘液用粘液吸除器吸除子宮頸粘液對(duì)青年母牛或子宮頸通過困難的供體牛可先用子宮頸擴(kuò)張棒擴(kuò)張子宮頸，再吸除子宮頸粘液。4.2.4采胚通過直腸把握將帶有鋼芯的沖胚管經(jīng)過子宮頸輕輕地插入一側(cè)子宮角大彎根氣8l固至 7。采時(shí)采吊在陰部10m（Y采，入0l量0l。沖完側(cè)子角后鋼芯插入胚管并氣，心固鋼芯，把采胚退到宮體轉(zhuǎn)向入另側(cè)子角，復(fù)上述作。4.25采胚后處理素0萬U和鏈霉素100萬U或1%液0l射PG04在胚2d射0.4mgP。4.3檢胚4.3.1回收液處理4.3..1集卵杯法用20G針頭的注射吸20ml沖胚液從上下沖洗集卵杯內(nèi)側(cè)的龍網(wǎng)4，清杯中泡沫鏡檢。4..12過濾法：胚時(shí)去回液，后將中留的20l回收液入平，再少量卵液洗過杯2次一并入平鏡檢。4..2鏡檢將回沖胚的平在10倍體視微鏡，上到、從到右或從外內(nèi)Z徑00m將到的胎移培養(yǎng)皿中保存小中，后將一體母的胚從滴中部出移新液胎3至0量。3類2天物份司 案胚胎發(fā)育階段分類應(yīng)符合表1要求。表1胚胎發(fā)育階段和形態(tài)特征胚胎發(fā)育階段 形態(tài)特征（ya，含有6個(gè)細(xì)胞以上，卵球緊界限晰，沒有形EM）致密桑椹胚（Compctedmorul，CM）早期囊（Earylasocst，E）

成致密細(xì)團(tuán)。卵裂進(jìn)步裂小縮團(tuán)狀看清卵裂球限細(xì)團(tuán)據(jù)帶的60%7%空間。細(xì)胞中現(xiàn)在囊細(xì)團(tuán)據(jù)明內(nèi)的70~0%空。已經(jīng)化滋層內(nèi)密、色暗內(nèi)細(xì)囊胚（Blsoyst，BL）

胞團(tuán)囊腔顯主征滋層內(nèi)胞團(tuán)的形比容區(qū)。的胎胞滿個(gè)透明帶。擴(kuò)張胚（Epaddbatcst，EXB）

整個(gè)胎直增大囊胚充分張，透明之間無隙，明帶薄，約是來厚的1/3。孵化囊胚（Hatchig正處于孵化階段的胚胎透明帶破裂或胚胎細(xì)胞團(tuán)blsoyt，H） 正在脫出或者已脫離透明帶。4.3.4胚胎發(fā)育日齡標(biāo)準(zhǔn)胚胎發(fā)育日齡標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合2要求。表2胚胎發(fā)育日齡標(biāo)準(zhǔn)段齡段齡胞d胚d-胞d胚d-胞d囊胚d-胞d胚d-胞 d 胚 d胚d4.3.5胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)胚胎質(zhì)量形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)應(yīng)符合3的要求。表3胚胎形態(tài)學(xué)鑒定及分級(jí)等級(jí) 特 征胚胎發(fā)育階段與胚齡一致透明帶光滑無缺陷胚胎細(xì)胞團(tuán)形態(tài)完整輪A級(jí)或于%。，裂B級(jí)球大小基本一致，色澤和細(xì)胞透明度良好，變性及游離細(xì)胞約占%。C級(jí)變3天物份司 案暗，卵裂球較松散游離，變性及游離細(xì)胞約占30%~50?？捎米黪r胚移植。D級(jí)未受精卵，或發(fā)育停滯變性、卵裂球不規(guī)則、少而散級(jí)不可用。4.4胚胎洗滌4.4.1胚胎應(yīng)用無菌的保存液洗滌5次，每次洗滌不少于200μl。4.4.2每組清洗胚胎數(shù)不能超過10枚。4.4.3每次清洗應(yīng)更換無菌吸管。4.4.4每次清洗胚胎帶入平皿中的液體量不能超過1%。4.5胚胎冷凍保存與解凍4.5.1乙二醇冷凍胚胎直接移植法程序4.5.1.1將胚胎放入1.5mL或18mol/L乙二醇冷凍保護(hù)液中，平衡0min，迅速裝入0.25ml細(xì)管。裝管順序：乙二醇液，氣泡，含有胚胎的乙二醇液，氣泡，乙二醇液，封口。每支細(xì)管可裝1枚或1枚以上胚胎。見下圖：棉塞 乙二醇液 乙二醇液+胚胎 乙二醇液封口處標(biāo)簽管氣泡 氣泡4.5.1.標(biāo)記裝管后，采用聚乙烯醇粉或封口機(jī)封口，或用標(biāo)簽塞插入封口端，標(biāo)記內(nèi)容：生產(chǎn)單位（代號(hào)）標(biāo)記品種和供體牛號(hào)及種公牛號(hào)，胚胎發(fā)育階段、等級(jí)及數(shù)量、胚胎生產(chǎn)時(shí)間等，乙二醇冷凍的胚胎應(yīng)標(biāo)記直接T。4.3植胚入-6℃或-7℃冷凍儀平衡5min后，用經(jīng)過液氮冷卻后的鑷子夾住塑料細(xì)管封口端（遠(yuǎn)離胚胎端）植冰。4.5.1.4冷凍：植冰后，平衡10min，以0.3℃/min~0.5℃/min速降溫到-32℃~-35℃時(shí)，平衡10min，把細(xì)管投入液氮中。4.5.2解凍：從液氮罐中取出細(xì)管，空氣中停留5s，投入32℃水浴中，待，。4天物份司 案附錄A試劑與藥品需液A.1素。A..20.1%新潔爾。A.1.3生。A.1..4促卵泡素（H。A.1.5前P。A.2液A.21碘酊。A..201%。A.2.3生。A.2.42%。A.2.5。A.2.6。附錄B 設(shè)備與耗材B.1材.15m、、、50m性射及。B..2。B..3CID放器。B..4用。B.2集材B..1用。B..2可延伸采胚。B..3用。B..4用。B.2.524”。B..6。B..7。B82l注器。B.90器。B.05器。1杯。B.2.2徑1培養(yǎng)皿。B.2.3。.41ml容量。B.2.5封，%酒精棉。B.3材5天物份司 案B..1體視顯微鏡X。B..2。B..3徑培養(yǎng)皿。B..4。B..5。B360.5塑細(xì)管。B..70.2μ。B..8細(xì)。B..9。B.3.0標(biāo)簽。附錄C 器具的洗滌與消毒C.1具滌C..1滌C.1..1浸泡用5%稀溶浸泡1h以。C.1..2和如高級(jí)洗衣粉或洗潔精）洗刷，洗刷時(shí)滌（20~）n中洗。C.1..3間應(yīng)于h。C.1..4，用，蒸水洗(～)。C..2洗C.1.2.1C.1.2.2

。H沸1n～n%鹽酸浸泡30n來和各清洗2～。C..3洗器過物，集應(yīng)沖干，干。C.2器具毒.1毒6天物份司 案C.2.1.1、培養(yǎng)板等）。C.2..2培面5燈，使每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，容器內(nèi)側(cè)向上，塑料吸管需垂直置于紫外燈下照射n。C..2菌及后0理1h~1.5h在度至0。C..3菌屬高、液體石蠟油等。上述物品經(jīng)包裝放入高壓滅菌器內(nèi)，在12℃（0.105MPa）高壓滅菌in。C..4過毒胚胎培用0.22μmPBS用0.45μm濾膜過，過濾的23。C..5毒聚乙烯沖胚管以及乳膠管等可在7液毒n沖用液。附錄D 放置陰道栓方法D.1準(zhǔn)備作D.1.1用C器放CIR。D.1.2。D.1.3。D.2操作D.2.10.1液。D.2.2CIIR兩角水平。D.2.3置R時(shí)一定要注意不要造。7天物份司 案附錄E供體牛超排、采卵及胚胎冷凍記錄表供體牛超排、采卵及胚胎冷凍記錄表如表E。表E 表及：牛號(hào) 期 品種 量間 胎次 間超排處理程序日/月 備 注 ＡＭ AM AM 藥物廠家 批 號(hào)撤栓 處理人員：發(fā)情時(shí)間：輸精時(shí)間 一次 二次 三次 種公牛號(hào) 輸精者采胚 操作者：采胚日期年月日 時(shí)直檢結(jié)果采胚 獲卵總數(shù) 合計(jì) A級(jí)可用胚胎B級(jí) C級(jí) 合計(jì)

不可用卵未受精 變性結(jié)果鮮胚移植胚胎冷凍 冷凍數(shù)量冷凍儀

貯存罐號(hào)：提桶號(hào)：保存液：型號(hào) 冷凍液：上機(jī)運(yùn)行 植冰溫度： 間： 結(jié)：年月 日 時(shí) 分至?xí)r分記字 備：8天物份司 案附錄F胚胎生產(chǎn)和移植費(fèi)用結(jié)構(gòu)分解1、每頭供體牛使用費(fèi)為2100元。主要費(fèi)是因超處理耽誤70天配種時(shí)間，70天飼養(yǎng)為2100元（每天30元。2、超排理藥品用每頭為950元。主要用于進(jìn)口CID，每頭100元；進(jìn)口促卵泡素FH每頭800元；產(chǎn)前烯（PG，每頭為10元；精液費(fèi)為40元4支每支10元。3、實(shí)驗(yàn)室儀器及耗材費(fèi)用，每頭1796元，詳見下表：100頭牛只胚胎生產(chǎn)儀器及耗材情況表序號(hào) 項(xiàng)目 數(shù)量1胚胎冷凍儀12 雙目顯微鏡 1

單價(jià)97,000.0046,000.00

總價(jià)97,000.0046,000.003 母牛用3路胚胎采集直徑6,長(zhǎng)580mm) 1 5,734.00 5,734.004 2m軟管–用于直徑6mm的采胚器(per5) 545.0025.005 可延伸采胚管，有黑色刻度，直徑6mm0920020.006

青年母牛用2路胚胎采集器(直徑4mm,長(zhǎng)510mm)

1 5,800.00 5,800.007 青年母牛采胚性氣球(pr)8 氣球鉗

5 150.001 1,800.00

750.001,800.009 青年母牛用2路采胚管1，CH2，5cc 1 280.00 280.0010 24”采胚管鋼芯CH18或CH20 1 269.00 269.001 CH18或H20采胚器軟管，含過濾器 1 460.00 460.0012 超薄胚胎移植手套1X1per20boxesf100)13 宮頸擴(kuò)張器

100 1502 1,980.00

150.003,960.0014 URFLSH采胚液1升(per4) 4 155.00 620.0015 胚胎保存液20ml(per4)16 乙二醇胚胎冷凍稀釋劑20ml

4 85.0 340.004 93.0 372.0017 用于胚胎移植采胚器的Z器18 杯形過濾器19 50個(gè)過濾器，0.22μ，用于稀釋液過濾20 胚胎移植潷析器

5 265.002 380.0012,780.001 1,950.00

1,325.00760.002,780.001,950.0021 6孔培養(yǎng)皿(0個(gè)) 0 49.0 490.0022 PETRI培養(yǎng)皿100x10020個(gè)) 0 18.0 360.0023 黃色直接輸胚管0,25l帶DT標(biāo)識(shí)(