抗原抗體反響后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。抗原抗體反響后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。抗原抗體反響后，利用特別儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法⑴熒光物質1〕熒光色素能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素〔fluoresceinisothiocyanate，FITC〕為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸取光波長為490--495nm，最大放射光波長520--530nm，呈現光明的黃綠色熒光，構造式如下：Ⅰ熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明〔rhodamine，RIB200〕為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質穩定，可長期保存。構造式如下：最大吸取光波長為570nm，最大放射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。550nm620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠比照染色效率較低。⑵其他熒光物質1〕酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發出熒光，激發光波長為360nm，放射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。22〕鑭系螯合物3價稀土鑭系元素如銪〔Eu3〕、鋱〔Tb3〕、鈰〔Ce3〕等的螯合物經激發后也可放射特征性的熒光，其中以Eu3應用最廣。Eu3螯合物的激發光波長范圍光免疫測定。免疫熒光常見熒光編輯編輯免疫熒光熒光素1)FITC2)RB2001)FITC2)RB2003)TRITC4〕鑭系：Eu、Tb5)PE6〕其它常見熒光素的特性1)FITC：黃色結晶粉末，吸取光：490~495nm，放射光：520~530nm，光明的黃綠色熒光。2)RB200570nm595~600nm，橘紅色熒光。3)TRITC550nm620nm，橙紅色熒光。4〕鑭系：Eu、Tb5)PE490~560nm595nm，紅色熒光。6〕其它：酶作用后產生熒光物質。免疫熒光酶作用生物質酶底物產物激發光放射光酶底物產物激發光放射光Β-GMUGMU360450APMUPMU360450HRPHPA317414⑷適宜熒光素的選擇1〕具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。熒光素-N=C+NH-蛋白質熒光素-N-C-N-蛋白質‖︱︱‖︱SHHSH2〕熒光效率高，標記后下降不明顯。3〕熒光色澤與背風光澤比照鮮亮。4〕標記后能保持生物學活性和免疫活性5〕標記方法簡潔、快速。6〕安全無毒[1]免疫熒光試驗步驟編輯編輯免疫熒光直接法測抗原⑴⑴根本原理將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反響。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。⑵試劑與儀器磷酸鹽緩沖鹽水〔PBS〕：0.01mol/L，pH7.40.01mol/L，pH7.4的PBS進展稀釋9份+pH9.20.2M1份配制搪瓷桶三只〔0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml〕有蓋搪瓷盒一只〔內鋪一層浸濕的紗布墊〕熒光顯微鏡玻片架濾紙37℃溫箱等。⑶試驗步驟①0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上，10min后棄去，使標本保持肯定濕度。②滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全掩蓋標本，置于有蓋搪瓷盒內，保溫肯定時間〔參考：30min〕。③0.01mol/L，pH7.4PBS沖洗后，再按挨次過0.01mol/L，pH7.4的PBS3-5min，不時振蕩。④蓋玻片掩蓋。⑤馬上用熒光顯微鏡觀看。觀看標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：〔-〕無熒光；〔±〕極弱的可疑熒光；〔+〕熒光較弱，但清楚可見；〔++〕熒光光明；〔+++--++++〕“++”〔±〕或〔-〕，即可判定為陽性。⑷留意事項稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀看。10min到數小時，一般30min已足夠。染色溫度多承受室溫〔25℃左右〕，高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原〔如流行性乙型腦炎病毒〕可承受0-2℃的低溫，延長染色時間。37℃30min效果好的多。為了保證熒光染色的正確性，首次試驗時需設置下述比照，以排解某些非特異性熒光染色的干擾。①1-20.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性比照〔抑制試驗〕：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。③陽性比照：的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。假設標本自發熒光比照和特異性比照呈無熒光或弱熒光，陽性比照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照耀超過3min好在當天觀看，隨著時間的延長，熒光強度會漸漸下降。免疫熒光間接法測抗體⑴⑴根本原理染色程序分為兩步，第一步，用未知未標記的抗體〔待檢標本〕加到抗原標本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結合，然后洗滌，除去未結合的抗體。其次步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。假設第一步發生了抗原抗體反響，標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定未知抗體。⑵試劑與儀器磷酸鹽緩沖鹽水〔PBS〕：0.01mol/L，pH7.40.01mol/L，pH7.4PBS進展稀釋。搪瓷桶三只〔0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml〕有蓋搪瓷盒一只〔內鋪一層浸濕的紗布墊〕熒光顯微鏡玻片架濾紙37℃溫箱等。⑶試驗步驟0.01mol/L，pH7.4的PBS于抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持肯定濕度。。將玻片置于有蓋搪瓷盒內，37℃30min。取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4PBS1-2次，然后按挨次0.01mol/L，pH7.4PBS5min，不時振蕩。稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保溫30min。3。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀看，結果判定同直接法。⑷留意事項1h4℃4h，時間過長，會使熒光減弱。每次試驗時，需設置以下三種比