主要內容TCA準備階段TCA循環階段TCA產能計算TCA的調節TCA雙重作用本文檔共49頁；當前第1頁；編輯于星期二\5點18分TCA背景知識1、為什么稱為檸檬酸循環、三羧酸循環（Tricarboxylicacidcycle,TCA）、Krebs循環？

在有氧的情況下，葡萄糖酵解產生的丙酮酸氧化脫羧形成乙酰CoA。乙酰CoA經一系列氧化、脫羧，最終生成C2O和H2O并產生能量的過程，稱為檸檬酸循環，亦稱為三羧酸循環(tricarboxylicacidcycle),簡稱TCA循環。由于它是由H.A.Krebs（德國）正式提出的，所以又稱Krebs循環。本文檔共49頁；當前第2頁；編輯于星期二\5點18分“Itisconvenienttouseabrieftermforthekindofscheme.Itsessentialfeatureistheperiodicformationofanumberofdi-andtricarboxylicacids.Asthereisnotermwhichwouldserveasacommondenominatorforallthevariousacids,itseemedreasonabletonamethecycleafterone,orsome,ofitscharacteristicandspecificacids.Itwasfromsuchconsiderationsthattheterm"citricacidcycle"wasproposedin1937.”（HansA.Krebs,Thecitricacidcycle,NobelLecture,December11,1953）Krebs,1901-1981本文檔共49頁；當前第3頁；編輯于星期二\5點18分BriefhistoryofTCAThefirstmajorinvestigationintotheintermediarymetabolismofoxidationwasthatofThunberg,whoexaminedsystematicallytheoxidizabilityoforganicsubstancesinisolatedanimaltissues.Between1906and1920hetestedtheoxidationofover60organicsubstances,chieflyinmuscletissue.Hediscoveredtherapidoxidationofthesaltsofanumberofacids,suchaslactate(乳酸鹽),succinate(琥珀酸鹽),fumarate(延胡索酸鹽),malate(蘋果酸鹽),citrate(檸檬酸鹽),andglutamate(谷氨酸鹽).本文檔共49頁；當前第4頁；編輯于星期二\5點18分In1932,Krebswasstudyingtheratesofoxidationofsmallorganicacidsbykidneyandlivertissue.Onlyafewofsubstanceswereactiveintheseexperiments---notablysuccinate,fumarate,acetate,malate,andcitrate.本文檔共49頁；當前第5頁；編輯于星期二\5點18分AnimportantdevelopmentcamefromthelaboratoryofSzent-GyorgyiofSzegedin1935,whoconfirmedonpigeonbreastmuscletherapidoxidationoftheC4-dicarboxylicacids-succinic,fumaric,malic,andoxaloaceticacids-andarrivedatthenewconclusionthatthosedicarboxylicacidswerelinkedbyanenzymaticpathwaythatwasimportantforaerobicmetabolism.

本文檔共49頁；當前第6頁；編輯于星期二\5點18分AdecisivecontributiontothefieldwasmadeinMarch1937byMartiusandKnoop,whodiscoveredα-ketoglutarate(α-酮戊二酸)

asaproductofcitrateoxidation.Becauseitwasalreadyknownthatα-ketoglutaratecouldbeenzymaticallyoxidizedtosuccinate,thepathwayfromcitratetooxaloacetatewasseemedas:本文檔共49頁；當前第7頁；編輯于星期二\5點18分In1937,Krebsfoundthatcitratecouldbeformedinmusclesuspensionsifoxaloacetateandeitherpyruvateoracetatewereadded.Now,hegetacycle:本文檔共49頁；當前第8頁；編輯于星期二\5點18分TCA背景知識2、細胞呼吸（cellrespiration）要經歷三個階段：糖酵解階段、檸檬酸循環階段、氧化磷酸化階段。3、糖酵解的產物丙酮酸進入TCA之前有一準備過程，即形成乙酰CoA。本文檔共49頁；當前第9頁；編輯于星期二\5點18分TCA準備階段丙酮酸在丙酮酸脫氫酶系催化下氧化脫羧形成乙酰輔酶A。丙酮酸脫氫酶系復合物含三種酶和五個輔助因子E1:pyruvatedehydrogenase,thiaminepyrophosphate(TPP)E2:dihydrolipoyltransacetylase,lipoicacid,coenzymeA-SH

E3:dihydrolipoyldehydrogenase,NAD+,FADIRREVERSIBLE本文檔共49頁；當前第10頁；編輯于星期二\5點18分TCA準備階段

H+丙酮酸脫氫酶系作用機理（1）1.丙酮酸與TPP結合并脫羧形成羥乙基TPP。2.羥乙基TPP氧化轉變成乙酰基同時轉移到E2的輔基硫辛酰胺上。3.在E2上的乙酰基在E2催化下轉移到CoASH上形成游離的乙酰CoA.從而形成了一個高能硫酯鍵。本文檔共49頁；當前第11頁；編輯于星期二\5點18分ThemechanisticdetailsofthefirstthreestepsofthepyruvatedehydrogenasecomplexreactionTCA準備階段本文檔共49頁；當前第12頁；編輯于星期二\5點18分TCA準備階段

丙酮酸脫氫酶系作用機理（2）4.還原型的E2將二個SH基H轉移到E3的輔酶FAD上形成還原型FADH5.E3上的還原型的FADH將H交給NAD+形成NADH，E3輔基又形成氧化型的FAD本文檔共49頁；當前第13頁；編輯于星期二\5點18分TCA準備階段

丙酮酸脫氫酶系反應圖解E1E3本文檔共49頁；當前第14頁；編輯于星期二\5點18分TCA準備階段

砷化物對硫辛酰胺的毒害作用

有機砷化物和亞砷酸能與丙酮酸脫氫酶系中的E2輔基硫辛酰胺共價結合，使還原型的硫辛酰胺形成失去催化能力的砷化物。這類砷化物同樣表現在對酮戌二酸脫氫酶系的抑制上。R-As=O+HSHSRSRSR’-As+H2O本文檔共49頁；當前第15頁；編輯于星期二\5點18分TCA概貌

2C6C檸檬酸6C異檸檬酸5C酮戌二酸4C琥珀酰CoA4C琥珀酸4C延胡索酸4C蘋果酸4C草酰乙酸本文檔共49頁；當前第16頁；編輯于星期二\5點18分

1、草酰乙酸與乙酰輔酶A形成檸檬酸—催化此反應的酶為檸檬酸合酶；—反應的中間產物為檸檬酰輔酶A；—檸檬酸合酶屬于調控酶，其活性受ATP、NADH、琥珀酰CoA、酯酰CoA等的抑制；另一種抑制劑是丙酮酰CoA。—它是TCA循環的限速酶，由氟乙酸形成的氟乙酰CoA可被該酶催化形成氟檸檬酸，從而抑制下一步的順烏頭酸酶催化的反應。此稱為致死性合成反應。TCA循環階段S-CoAintermediate本文檔共49頁；當前第17頁；編輯于星期二\5點18分哺乳動物體內檸檬酸合成酶以二聚體形式存在。與草酰乙酸的結合使酶發生有利于和乙酰CoA結合的形變。TCA循環階段檸檬酸合成酶的單聚體形式，綠色原子為檸檬酸，粉色原子為CoA本文檔共49頁；當前第18頁；編輯于星期二\5點18分TCA循環階段草酰乙酸與乙酰輔酶A形成檸檬酸，反應的中間產物為檸檬酰輔酶A。本文檔共49頁；當前第19頁；編輯于星期二\5點18分

２、檸檬酸異構形成異檸檬酸—催化此反應的酶為烏頭酸酶；—反應的中間產物為順烏頭酸；—反應為先脫水后水化；—由于反應生成的異檸檬酸在下一步反應中迅速被氧化而使反應向生成異檸檬酸的方向進行。TCA循環階段本文檔共49頁；當前第20頁；編輯于星期二\5點18分順烏頭酸酶催化檸檬酸異構化為檸檬酸，反應分兩步進行，經歷一個順烏頭酸中間體。反應具有嚴格的空間特異性。TCA循環階段本文檔共49頁；當前第21頁；編輯于星期二\5點18分順烏頭酸酶活性位點的鐵硫聚簇。TCA循環階段本文檔共49頁；當前第22頁；編輯于星期二\5點18分氟乙酸到氟檸檬酸的轉化TCA循環階段本文檔共49頁；當前第23頁；編輯于星期二\5點18分

３、異檸檬酸氧化生成－酮戌二酸—催化此反應的酶為異檸檬酸脫氫酶；—反應為TCA二次氧化脫羧中的第一個反應；—反應中間產物為不穩定的草酰琥珀酸；—既有以NAD+為輔酶的異檸檬酸脫氫酶，也有以NADP+為輔酶的異檸檬酸脫氫酶。—異檸檬酸脫氫酶是變構調節酶，其活性受ADP和NAD+的變構激活，受ATP和NADH的變構抑制。TCA循環階段-脫羧反應本文檔共49頁；當前第24頁；編輯于星期二\5點18分TCA循環階段本文檔共49頁；當前第25頁；編輯于星期二\5點18分

4、－酮戌二酸氧化脫羧生成琥珀酰CoA—催化此反應的酶為－酮戌二酸脫氫酶復合體，該酶由－酮戌二酸脫氫酶E1、二氫硫辛酰轉琥珀酰酶E2和二氫硫辛酰脫氫酶E3及六種輔助因子TPP、硫辛酸、CoA、NAD+、FAD、Mg2+組成；—反應為TCA二次氧化脫羧中的第二個反應；—反應釋放的能量主要存于琥珀酰CoA的高能硫酯鍵中；TCA循環階段本文檔共49頁；當前第26頁；編輯于星期二\5點18分

4、－酮戌二酸氧化脫羧生成琥珀酰CoA—－酮戌二酸脫氫酶是變構調節酶，其活性受產物琥珀酰CoA、NADH和高能ATP的變構抑制。—與丙酮酸脫氫酶復合體中E1不同的是該酶不受磷酸化與去磷酸化的共價修飾調節作用；TCA循環階段本文檔共49頁；當前第27頁；編輯于星期二\5點18分5、琥珀酰CoA轉化為琥珀酸并釋放高能磷酸鍵—催化此反應的酶為琥珀酰CoA合成酶或稱琥珀酰硫激酶；—該反應為TCA是唯一直接產生高能磷酸鍵的步驟，也是一步底物水平磷酸化產生能量的步驟；—反應生產的GTP在蛋白質的生物合成中起磷酰基供體及激活信號蛋白的作用，也可以與ADP磷酸化生成ATP相偶聯產生能量。TCA循環階段本文檔共49頁；當前第28頁；編輯于星期二\5點18分琥珀酰CoA合成酶反應機制TCA循環階段本文檔共49頁；當前第29頁；編輯于星期二\5點18分6、琥珀酸脫氫生成延胡索酸—催化此反應的酶為琥珀脫氫酶；它以FAD為輔基；—該酶具有嚴格的立體專一性，即只生成反式延胡索酸；—與琥珀酸結構類似的化合物如丙二酸、戌二酸等是該酶的競爭性抑制劑。TCA循環階段本文檔共49頁；當前第30頁；編輯于星期二\5點18分TCA循環階段琥珀酸脫氫酶的鐵硫聚簇FAD和琥珀酸脫氫酶的共價結合本文檔共49頁；當前第31頁；編輯于星期二\5點18分7、延胡索酸水合成L-蘋果酸—催化此反應的酶為延胡索酸酶；—該酶具有嚴格的立體專一性，即只生成L-蘋果酸；TCA循環階段本文檔共49頁；當前第32頁；編輯于星期二\5點18分TCA循環階段延胡羧酸酶的兩種可能的反應機制本文檔共49頁；當前第33頁；編輯于星期二\5點18分8、L-蘋果酸脫氫生成草酰乙酸—催化此反應的酶為蘋果酸脫氫酶；—該酶的輔基為NAD+；—由于草酰乙酸與乙酰CoA合成檸檬酸的反應是高度放能反應，因此通過草酰乙酸的不斷消耗來驅使該反應不斷向生成草酰乙酸方向進行。TCA循環階段本文檔共49頁；當前第34頁；編輯于星期二\5點18分TCA循環階段以NAD+作為輔酶的脫氫酶的空間特異性比較本文檔共49頁；當前第35頁；編輯于星期二\5點18分TCA循環階段蘋果酸脫氫酶的結構本文檔共49頁；當前第36頁；編輯于星期二\5點18分TCA循環階段TCACycle乙酰草酰成檸檬，檸檬易成α-酮琥酰琥酸延胡索，蘋果落在草叢中。本文檔共49頁；當前第37頁；編輯于星期二\5點18分1、總反應—離開循環的二分子CO2的碳并非來自進入循環的乙酰輔酶A，而分別來自異檸檬酸脫羧和-酮戌二酸脫羧反應；—每循環一次共產生一個GTP、消耗二個水分子；—每一次循環有4次氧化反應，共產生3分子NADH和1分子FADH2；—每次循環產生的能量：1（GTP）+32.5(NADH)+11.5(FADH2)=10ATP—若從丙酮酸算起則產生：10+2.5(NADH)=12.5ATP—若從葡萄糖算起則產生：12.52+2+2(NADH)2.5=32ATPTCA能量計算AcetylCoA+3NAD++FAD+GDP+Pi+2H2O2CO2+3NADH+FADH2+GTP+2H++CoA本文檔共49頁；當前第38頁；編輯于星期二\5點18分TCA中C的歸宿本文檔共49頁；當前第39頁；編輯于星期二\5點18分TCA中C的歸宿本文檔共49頁；當前第40頁；編輯于星期二\5點18分TCA的調控可看成來自二方面：TCA循環本身所具有的內部相互制約系統的調控和ADP、ATP、Ca2+對循環的調控。1、調控丙酮酸脫氫酶復合體TCA的調控本文檔共49頁；當前第41頁；編輯于星期二\5點18分TCA的調控是通過循環的別構效應劑和共價修飾實現的。1、調控丙酮酸脫氫酶復合體TCA的調控本文檔共49頁；當前第42頁；編輯于星期二\5點18分本文檔共49頁；當前第43頁；編輯于星期二\5點18分丙酮酸脫氫酶復合體的調控1.1.產物調控即由NADH和乙酰CoA控制。這二種物質是和酶的作用底物NAD+和CoA競爭酶活性部位。乙酰CoA抑制E2、NADH抑制E3。1.2.磷酸化和去磷酸化的調控E2上結合有二種酶：激酶和磷酸化酶。激酶使丙酮酸脫氫酶組分磷酸化而失活，磷酸酶則脫去丙酮酸脫氫酶上的磷酸基團而活化。Ca2+可使磷酸酶活化從而激活丙酮酸脫氫酶。TCA的調控本文檔共49頁；當前第44頁；編輯于星期二\5點18分2、調控TCA循環的三個限速反應3、ATP、ADP和Ca2+對TCA的調控TCA的調控本文檔共49頁；當前第45頁；編輯于星期二\5點18分TCA的中間產物為許多生成合成提供前體物質。TCA的雙重作用OXALOACETATEREPLENISHEDBYPYRUVATECARBOXYLASE本文檔共49頁；當前第46頁；編輯于星期二\