PlatformTechnologiesofBiology生物技術平臺的兩根支柱：浙江大學細胞培養-緒論細胞培養技術&單克隆抗體技術浙江大學細胞培養-緒論細胞培養技術林旭璦副教授

醫學院病原生物學系浙江大學細胞培養-緒論林旭璦：

辦公室:醫學院科研C817

電話:88208294

實驗室:科研C804～810

E-mail:浙江大學細胞培養-緒論關于考試：

開卷，實驗課結束前上交（10.26-10.27）

（A4紙張打印試題，手寫答案附后）

10+40+50浙江大學細胞培養-緒論參考書谷鴻喜，張鳳民，凌虹.細胞培養技術.北京大學醫學出版社，2012章靜波.組織和細胞培養技術.人民衛生出版社，2011譚玉珍.實用細胞培養技術.

高等教育出版社，2010浙江大學細胞培養-緒論一、緒論

二、細胞培養基礎知識

培養前準備/培養基/培養設備

三、細胞培養基本技術

培養技術/培養物的固定、染色/顯微鏡觀察

四、細胞培養中的細節問題內容浙江大學細胞培養-緒論組織培養的誕生與發展簡史

組織培養的優缺點

組織培養常用術語

組織培養的實際意義

細胞系或細胞株的命名緒論浙江大學細胞培養-緒論細胞培養(cellculture)

從動物體內取出細胞或者組織，模擬體內的生理環境，在無菌、適溫和豐富的營養條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術。細胞培養、組織培養和器官培養浙江大學細胞培養-緒論將活體的一小片組織放在盛有培養液的玻璃或塑料培養器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長的過程。B、組織培養將組織塊用機械方法或酶解法分離成單個細胞，做成細胞懸液，再培養于固體基質上，成單層細胞生長，或在培養液中呈懸浮狀態培養的技術。A、細胞培養C、器官培養是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結構和功能的培養技術。浙江大學細胞培養-緒論一、組織（細胞）培養發展史年鑒1878ClaudeBernard:證明一個器官的生理系統在個體死亡以后仍然可以人工維持。

1885WilhelmRoux:在一個生理溶液中維持一塊雞胚的活性并觀察其發育，從而證實該發育與雞胚的其他部分無關。1907RossHarrison:利用凝固的青蛙淋巴液作為培養基，在體外培養青蛙神經嵴，維持其活性達數星期，并觀察到了神經纖維的生長，從而解決了神經纖維的來源問題。RossHarrison被人稱為細胞培養之父。浙江大學細胞培養-緒論1910Burrows:率先在血漿凝塊中長期培養雞胚細胞。

1911Lewis:以海水、血清、胚胎提取物、鹽和蛋白胨為原料配制成了第一個人工的細胞培養液，并觀察到了單層細胞的有限生長。

1916Rous&Jones:開創用胰酶來收獲貼壁生長的細胞。

1923-1931Carrel:研制T型培養瓶大規模培養細胞。1927Carrel&Rivera:制造了第一個病毒疫苗——牛痘疫苗。1933Gey:發明了轉管培養細胞的技術。一、組織（細胞）培養發展史年鑒浙江大學細胞培養-緒論1948Fisher:研制成了第一個化學成分清楚的細胞培養液CMRL1006。1952Gey和同事:分離培養了HeLa細胞。1952Dulbecco:發明了噬斑法，用長滿的單層細胞檢測病毒。1954Abercrombie:觀察到了體外培養細胞接觸抑制的現象。1961Hatflick&Moorhead:發現人成纖維細胞在一定的代數之后會死亡。1965Ham:配制了第一個無血清培養液。1975K?hler&Milstein:成功得到第一個用于單抗生產的雜交瘤細胞株。一、組織（細胞）培養發展史年鑒浙江大學細胞培養-緒論1.研究的對象是活細胞

能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態、結構、生命活動等二、細胞培養的優點2.研究條件可以人為控制

選擇對象：均一性、重復性（類型/性質/階段）調節條件：化學、物理、生物等因素條件研究方法：各種研究技術、記錄方法浙江大學細胞培養-緒論3.研究的范圍比較廣泛

學科多：細胞學、免疫學、腫瘤學、生物化學、遺傳學、分子生物學等對象廣：各種動物：低等動物--高等動物--人類

一種動物：不同年齡--

不同組織：正常或異常（腫瘤--）二、細胞培養的優點4.研究的費用相對較經濟

可提供大量、同一時期、重復性好的、生物學性狀相似的實驗對象浙江大學細胞培養-緒論人工所模擬的條件與體內實際情況仍不完全相同。當細胞被置于體外培養后，生活在缺乏動態平衡的環境中久了，必然發生變化。1.與體內主要不同

相對孤立、單一

缺乏體內的系統作用、失去神經體液的調節和細胞相互間的影響

2.主要表現

失去原有組織結構和細胞形態

分化減弱或不明顯,

細胞趨向單一化二、細胞培養的缺點浙江大學細胞培養-緒論對于體外培養的細胞，應該把他們視作一種既能保持動物體內原細胞一定的性狀、結構和功能又具有某些改變的特定的細胞群體，而不能將之與體內的細胞完全等同。提示浙江大學細胞培養-緒論三、常用術語浙江大學細胞培養-緒論初代培養/原代培養（primaryculture）

從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養。初代培養物一旦進行傳代培養后，就成為細胞系。通常10代以內的培養物用作原代培養。--有限細胞系（finitecellline）生存期有限的細胞系，不能繼續傳代或傳代數有限。--連續細胞系或無限細胞系（infinitecellline）獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系，能連續傳代。傳代培養（sub-culture）

不論是否稀釋，在體外培養條件下，將細胞從一個培養器皿轉移至另一培養器皿。浙江大學細胞培養-緒論貼壁培養（anchorage-dependentculture）

細胞或培養物只有貼附于不起化學作用的物體（玻璃或塑料等無活性物體）的表面時才能生長、生存或維持功能。

不能表明細胞屬于正常或惡性轉化懸浮培養（suspensionculture）

細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養基中增殖的一種培養方式。

淋巴細胞、血液腫瘤細胞等浙江大學細胞培養-緒論細胞株（cellstrain）

通過篩選或克隆化從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的細胞。這些特性（有一定的標記染色體、特殊的抗原性等）在以后的培養中必須持續存在。

--有限細胞株（finitecellline）

生存期有限的細胞株。不能繼續傳代或傳代數有限--連續細胞株或無限細胞株（infinitecellline）

已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞株。能連續傳代。亞株（substrain）

由原細胞株進一步分離培養出與原株性狀有一定不同的細胞群浙江大學細胞培養-緒論二倍體細胞系或株

細胞群染色體數目具有與原供體二倍體細胞染色體數相同或基本相同（2n細胞占75％以上）的細胞群。在正常情況下具有限生命期，屬有限細胞系。

隨供體年齡和組織來源的不同，壽命長短各異。---人胚肺成纖維細胞可傳40-60代---人胚腎細胞只有8-10代---人胚神經膠質細胞15-30代為保持二倍體細胞能長期被利用，一般在初代或2-5代即大量凍存作為原種（stockcells），用時再進行繁殖，用后再繼續凍存，可供長期使用或延緩細胞的衰老。假二倍體：僅數目相同，而核型不同，即染色體形態有改變者。浙江大學細胞培養-緒論遺傳缺陷細胞系或株

從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細胞）培養的細胞，或用人工方法誘發突變的細胞，都屬遺傳缺陷細胞。

這類細胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。腫瘤細胞系或株

是現有細胞系或細胞株中最多的一類，我國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系由癌瘤建成，多呈類上皮型細胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。浙江大學細胞培養-緒論細胞凋亡（apoptosis）

細胞內死亡程序的開啟而導致細胞自殺的過程。

與機體正常發育、形態形成、消除多余細胞等生理過程密切相關。

主要形態特征為細胞皺縮、染色質聚集與周邊化，以及凋亡小體的形成。ATCC（Americantypeculturecollection）

美國模式培養物收集中心/美國菌種保藏中心。

除收集細菌、病毒外，還保藏有大量的細胞株（系）。浙江大學細胞培養-緒論體外轉化（invitrotransformation）

細胞在體外培養過程中發生與原代細胞形態、抗原、增殖或其它特性的可遺傳的變化，但不具有致瘤性。匯合（confluence）

在瓶中培養的細胞彼此匯合形成單層。細胞融合（cellfusion）

在體外培養條件下，經化學試劑（PEG）、病毒（滅活仙臺病毒）或物理方法（電脈沖）誘發，使不同種的體細胞融合產生雜交細胞。浙江大學細胞培養-緒論細胞周期（cellcycle）

細胞從前一次分裂結束開始至本次分裂結束所經歷的時相過程。DNA合成期（S期）、有絲分裂期（M期）、有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期（G1期）、DNA復制結束至有絲分裂開始的間隙期（G2期）。群體倍增時間（populationdoublingtime）

在對數生長期進行計算的細胞增加一倍所需的時間。細胞代時（cellgenerationtime）

單個細胞兩次連續分裂的時間間隔。浙江大學細胞培養-緒論群體密度（populationdensity）

培養器皿內，每單位面積或體積中的細胞數，多用細胞數/cm2表示。接觸抑制（contactinhibition）

當一個貼壁生長的體外正常細胞生長至與另一個細胞表面相互接觸時，便停止了分裂增殖，雖然相互緊密接觸，但不形成交叉重疊生長，也不再進入S期。飽和密度（saturationdensity）

在特定條件下，培養皿內能達到的最高細胞數，當細胞達到飽和密度后細胞群體停止繁殖，貼壁培養：細胞數/cm2；懸浮培養：細胞數/cm3。浙江大學細胞培養-緒論分子生物學生物工程臨床診斷和治療生物制品藥物開發四、細胞培養的現實意義浙江大學細胞培養-緒論單克隆抗體制備過程浙江大學細胞培養-緒論多莉克隆猴浙江大學細胞培養-緒論對已建成的各種細胞系或細胞株習慣上都給以名稱；細胞的命名無嚴格統一規定，大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解

HeLa：為供體患者的性名(來源于宮頸癌)CHO：中國地鼠卵巢細胞(ChineseHamsterOvary)宮—743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立NIH3T3；美國國立衛生研究所(NationalInstituteofHealth)建立,每3天傳代一次，每次接種3×106cell/ml。五、細胞系或細胞株的命名浙江大學細胞培養-緒論已建立細胞系或株的簽定、管理和使用培養簡歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態、細胞已傳代數等。凍存液：培養基和防凍液名稱。細胞活力：融解前后細胞接種存活率和生長特性。培養液：培養基種類和名稱(一般要求不含抗生素)，血清來源和含量。ATCC（Americantypeculturecollection）入庫細胞要求檢測項目如下：浙江大學細胞培養-緒論已建立細胞系或株的簽定、管理和使用細胞形態：類型，如為上皮或成纖維細胞等。核型：二倍體或多倍體，標記染色體的有無。無污染測驗：包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等。物種檢測：檢測同功酶，主要為G6PD和LDH，以證明細胞有否交叉污染。