演示文稿體內(nèi)藥物分析常用生物樣品處理方法和方法學驗證本文檔共63頁；當前第1頁；編輯于星期一\16點55分（優(yōu)選）體內(nèi)藥物分析常用生物樣品處理方法和方法學驗證本文檔共63頁；當前第2頁；編輯于星期一\16點55分1.為什么要對生物樣品進行處理？2.有哪些生物樣品？3.有哪些樣品處理方法？各自的特點。4.如何對分析方法進行驗證？5.有哪些參考標準？3本文檔共63頁；當前第3頁；編輯于星期一\16點55分生物樣品進行前處理的目的在于：1．藥物進入體內(nèi)后，經(jīng)吸收、分布、代謝，然后排出體外。在體液、組織和排泄物中除了游離型（原型）藥物之外，還有藥物的代謝物、藥物與蛋白質(zhì)形成的結(jié)合物、以及藥物或其代謝物與內(nèi)源性物質(zhì)，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯綴合物等多種形式存在，需要分離后測定藥物及代謝物。4一、處理的目的本文檔共63頁；當前第4頁；編輯于星期一\16點55分2．生物樣品的介質(zhì)組成比較復雜。如在血清中既含有高分子的蛋白質(zhì)和低分子的糖、脂肪、尿素等有機化合物，也含有Na＋、K＋、Cl-等無機化合物。這些成分會嚴重影響測定的準確性和靈敏度，同時會污染儀器。因此，為了保護儀器，提高測定的靈敏度，保證檢測結(jié)果的準確性和可靠性，必須對樣品進行前處理。5本文檔共63頁；當前第5頁；編輯于星期一\16點55分660%以上精力和花費用在樣品前處理上本文檔共63頁；當前第6頁；編輯于星期一\16點55分

生物樣品包括各種體液和組織，但實際上最常用的是比較容易得到的血液（全血、血漿、血清）、尿液、糞便、唾液。在一些特定的情況下選用乳汁、腦脊液等。7二、生物樣品的種類本文檔共63頁；當前第7頁；編輯于星期一\16點55分全血不易保存，且血細胞中含有更多的干擾物質(zhì)，影響測定，故很少采用全血測定藥物濃度。僅適用于血漿藥物濃度太低或者血漿藥物濃度波動大，且難以控制的藥物如：環(huán)孢霉素A。81全血本文檔共63頁；當前第8頁；編輯于星期一\16點55分測定血中藥物濃度通常是指測定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細胞的全血中的藥物濃度。將采取的血液置含有抗凝劑（如：肝素、EDTA）的試管中，混合后，3000至4000r/min離心，分離血細胞，上清液即為血漿。

92血漿本文檔共63頁；當前第9頁；編輯于星期一\16點55分10血漿中含有的物質(zhì)種類和比例本文檔共63頁；當前第10頁；編輯于星期一\16點55分血清是在采血后不加任何抗凝劑，于室溫下靜置15-30min，待其自然凝結(jié)后，離心，分離出上清液。血清顏色較血漿更淺，成分較血漿少了大部分的纖維蛋白，更易進行處理，且血漿及血清中的藥物濃度測定值通常是相同的。113血清本文檔共63頁；當前第11頁；編輯于星期一\16點55分

一般認為，當藥物在體內(nèi)達到穩(wěn)定狀態(tài)時，血漿中藥物濃度與藥物在作用點的濃度緊密相關(guān)，即血漿中的藥物濃度反映了藥物在體內(nèi)（靶器官）的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標。血漿和血清可以穩(wěn)定的冰凍保存，一般儲存在-20℃的條件，長期保存時可以保存在-80℃的條件下，是生物樣品檢測中最常用的樣本。12本文檔共63頁；當前第12頁；編輯于星期一\16點55分尿液主要成分是水、尿素及無機鹽類。尿樣采集后，為了保存，常會加入防腐劑。體內(nèi)藥物清除主要是通過尿液排出，藥物可以原型或代謝物及其綴合物等形式排出。尿液中藥物濃度較高，但尿液濃度受尿量的影響，通常變化較大，應(yīng)測定一定時間內(nèi)排入尿中藥物的總量。134尿液本文檔共63頁；當前第13頁；編輯于星期一\16點55分唾液中所含成分比較簡單，且容易獲得，但是只有少數(shù)藥物的唾液濃度和血漿游離藥物濃度具有相關(guān)性，實際使用不多，當藥物血漿結(jié)合率高的時候，唾液中藥物的濃度極低，很難檢測。145唾液本文檔共63頁；當前第14頁；編輯于星期一\16點55分采樣后除立即分析外，為防止藥物發(fā)生變化，應(yīng)：短期保存，可4℃冷藏；長期保存，可-20℃冷凍，不要反復凍融，必要時可以加入酶抑制劑和抗氧化劑。15生物樣品的保存：本文檔共63頁；當前第15頁；編輯于星期一\16點55分主要應(yīng)考慮生物樣品的種類，被測藥物的性質(zhì)和測定方法三個方面的問題。16三、常用的處理方法1.沉淀蛋白PPT2.液液萃取LLE3.固相萃取SPE本文檔共63頁；當前第16頁；編輯于星期一\16點55分171.沉淀蛋白①有機溶劑沉淀法加入水溶性的有機溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚。常用的有機溶劑有：乙睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等。

血漿或血清與有機溶劑的體積比為1:3時，就可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去，采用低溫高速速離心機16000r/min離心10min便可將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。本文檔共63頁；當前第17頁；編輯于星期一\16點55分實際應(yīng)用中，多是取50uL的血漿，加入500uL的有機溶劑，渦旋離心后，取上清進樣；若沉淀后，信號相應(yīng)不好，可嘗試更換有機溶劑或者在沉淀時，加入酸或堿，調(diào)節(jié)pH值，可能會對結(jié)果影響很大；常用的酸堿有：鹽酸，甲酸，乙酸，氨水等。18本文檔共63頁；當前第18頁；編輯于星期一\16點55分優(yōu)點：操作簡單，為方法開發(fā)中最先考慮使用的。缺點：只使用于樣品中濃度較高的藥物測定；且處理后，樣品中仍然會存在很多干擾物質(zhì)，對結(jié)果產(chǎn)生干擾；殘余的雜質(zhì)會堵塞色譜柱，污染儀器。19本文檔共63頁；當前第19頁；編輯于星期一\16點55分中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。常用的中性鹽：飽和硫酸胺、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽及枸櫞酸鹽等。鹽析的方法與有機溶劑提取法常并用，藥物的回收率較高。②加入中性鹽20本文檔共63頁；當前第20頁；編輯于星期一\16點55分2121③加入強酸當pH低于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)以陽離子形式存在，加入強酸，可與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽而沉淀。常用的強酸有：10%三氯醋酸等。血清與強酸的比例為1:0.6混合，高速離心,就可除去蛋白質(zhì)。在酸性下分解的藥物不宜用本法除蛋白。本文檔共63頁；當前第21頁；編輯于星期一\16點55分當pH高于蛋白質(zhì)的等電點時，金屬陽離子與蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基形成不溶性鹽而沉淀。常用的沉淀劑有：CuS04-Na2W04,ZnS04-NaOH等。含藥物血清與沉淀劑的比例為1:2混合，高速離心、分離后得上清液。22④加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑本文檔共63頁；當前第22頁；編輯于星期一\16點55分在測定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物時，常需用酶解法。在測定尿中的藥物濃度時，由于尿中藥物主要以綴合物的形式排除，較原型藥物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取，常用酶水解的方法。23④酶解法本文檔共63頁；當前第23頁；編輯于星期一\16點55分超速離心法平衡透析法最主要的應(yīng)用在測定血漿中游離的藥物濃度和藥物的血漿蛋白結(jié)合率。24其他的一些去除蛋白質(zhì)的方法：本文檔共63頁；當前第24頁；編輯于星期一\16點55分藥物在體內(nèi)吸收，需經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)運，所以多數(shù)藥物具有一定的脂溶性，而生物樣品中大多數(shù)內(nèi)源性雜質(zhì)是強極性的水溶性物質(zhì)，所以可以根據(jù)藥物分子與基質(zhì)之間極性的差異，使用適當?shù)挠袡C溶劑提取藥物，有機溶劑提取可一次除去大部分雜質(zhì)。252.液液萃取法LLE本文檔共63頁；當前第25頁；編輯于星期一\16點55分有機溶劑應(yīng)選擇穩(wěn)定，易揮發(fā)，低毒性，不與水相混溶的溶劑。常用的有機溶劑有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿等。應(yīng)用本法時需要考慮所選有機溶劑的特性、藥物的特點、有機溶劑相和水相的體積比及水相的pH值等。酸性藥物的解離：AH+H2OA-+H+堿性藥物的解離：B+H2OB++OH-藥物的解離常數(shù)pKa為藥物解離50%時溶液的pH值。26本文檔共63頁；當前第26頁；編輯于星期一\16點55分藥物的提取程度主要取決于水相的pH值。對于堿性藥物，最佳pH值要高于pKa1-2個單位；對于酸性藥物來說，則要低于pKa值1-2個單位；這樣就可使90%的藥物以非電離的形式存在從而更易溶于有機溶劑中。常用來調(diào)節(jié)pH值的物質(zhì)有：甲酸、乙酸、鹽酸或氨水、氫氧化鈉等。水相的PH值--影響液液萃取最關(guān)鍵的因素27本文檔共63頁；當前第27頁；編輯于星期一\16點55分具體的提取模式有兩種，直接提取和反提取法。優(yōu)點：樣品經(jīng)過提取后，可除去大部分雜質(zhì)，比較“干凈”；對有機溶劑蒸發(fā)后復溶，可以對樣品進行濃縮；大多數(shù)藥物具有脂溶性，應(yīng)用范圍廣。缺點：費時費力，操作繁瑣；且對血漿進行提取時，血漿中的脂質(zhì)會一起被提取出，當使用質(zhì)譜檢測器時，會在離子源處產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，嚴重干擾質(zhì)譜檢測結(jié)果的準確性！28本文檔共63頁；當前第28頁；編輯于星期一\16點55分方法摸索中，一般是使用以上溶劑，平行操作，同時提取，附加空白對照，比對結(jié)果，判斷哪種有機溶劑的提取效果最好；若均不理想，可以再混合使用以上溶劑，調(diào)整比例1:1,1:2,1:3的使用；在摸索合適的提取溶劑同時，可根據(jù)藥物的酸堿性嘗試著添加些酸、堿或者離子對試劑，提高回收率；提取過程中，一定要嚴控pH值，對于兩性藥物則需要使用緩沖溶液保證提取回收率的穩(wěn)定可重現(xiàn)。29本文檔共63頁；當前第29頁；編輯于星期一\16點55分30舉例：雌二醇的檢測取血漿樣品100uL，+同位素內(nèi)標20uL，+甲酸50uL，+正己烷1mL+叔丁基甲醚3mL，渦旋震蕩10min，3000r/min離心10min，-80℃冷凍10min，倒出上層有機層，40℃水浴氮氣吹干，+150uL丙酮溶解，+50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40℃水浴孵育20min，+磷酸鹽緩沖液2mL+叔丁基甲醚4mL，渦旋震蕩10min，3000r/min離心10min，-80℃冷凍10min，倒出上層有機層，40℃水浴氮氣吹干，流動相復溶。本文檔共63頁；當前第30頁；編輯于星期一\16點55分固相萃取(SolidPhaseExtraction，簡稱SPE)是從八十年代中期開始發(fā)展起來的一項樣品前處理技術(shù)。由液固萃取和液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來。主要通過固相填料對樣品組分的選擇性吸咐及解吸過程，實現(xiàn)對樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測靈敏度。313.固相萃取SPE本文檔共63頁；當前第31頁；編輯于星期一\16點55分固相萃取的基本原理和方法：SPE技術(shù)基于液-固相色譜理論，采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對樣品進行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過程；也可以將其近似地看作一種簡單的色譜過程。較常用的方法是使液體樣品通過一吸附劑，保留其中被測物質(zhì)，再選用適當強度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測物質(zhì)，從而達到快速分離凈化與濃縮的目的。也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測物質(zhì)流出。32本文檔共63頁；當前第32頁；編輯于星期一\16點55分33本文檔共63頁；當前第33頁；編輯于星期一\16點55分34萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！本文檔共63頁；當前第34頁；編輯于星期一\16點55分固相萃取操作一般有五步：活化——甲醇/乙腈潤濕小柱，活化填料；平衡——水或適當緩沖液沖洗平衡小柱；上樣——將樣品轉(zhuǎn)移上柱，抽去廢液；淋洗——水或緩沖液最大程度洗去干擾物；洗脫——用小體積的溶劑將被測物質(zhì)洗脫下來并收集。35本文檔共63頁；當前第35頁；編輯于星期一\16點55分1.正相色譜原理2.反相色譜原理3.離子交換原理36根據(jù)原理分類：本文檔共63頁；當前第36頁；編輯于星期一\16點55分37本文檔共63頁；當前第37頁；編輯于星期一\16點55分38SPE方法的優(yōu)點：1.不會發(fā)生乳化；2.適用范圍廣；3.提取效率高；4.方便快速，可以一次提取分離多種化合物；5.溶劑消耗少；6.易于實現(xiàn)自動化；7.離子交換固相萃取利用離子交換原理，同色譜柱的依據(jù)極性大小的分離原理不同，配合使用，可以最大限度的分離出藥物，去除干擾。目前商品化的固相萃取小柱（cartridge）已經(jīng)廣泛應(yīng)用。本文檔共63頁；當前第38頁；編輯于星期一\16點55分39三種方法的比較：本文檔共63頁；當前第39頁；編輯于星期一\16點55分將藥物進行化學衍生化的目的是：①使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)；②提高檢測的靈敏度；③增強藥物的穩(wěn)定性；④提高對光學異構(gòu)體分離的能力等。藥物分子中含有活潑H者均可被化學衍生化，如：-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能團的藥物都可被衍生化。404.化學衍生化法本文檔共63頁；當前第40頁；編輯于星期一\16點55分HPLC中化學衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化兩種方法。柱前衍生化分析前盡可能將藥物進行提取分離后再衍生化，防止其他含有相同的功能基團的雜質(zhì)也被衍生化，影響分離。柱后衍生化是藥物經(jīng)色譜柱分離之后進行的，所以可形成對檢測器具有高靈敏度的衍生物。HPLC法常用的衍生化試劑有鄰苯二醛、丹磺酰氯、熒胺等。

41本文檔共63頁；當前第41頁；編輯于星期一\16點55分42定量下限達10pg級別！本文檔共63頁；當前第42頁；編輯于星期一\16點55分待測藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況分析測定的目的與要求生物樣品的類型與預處理方法實驗室條件43體內(nèi)藥物分析方法的建立本文檔共63頁；當前第43頁；編輯于星期一\16點55分1.光譜分析法2.色譜法

3.毛細管電泳法4.免疫分析法5.同位素法44體內(nèi)藥物分析方法大致可歸為一下幾類：本文檔共63頁；當前第44頁；編輯于星期一\16點55分45體內(nèi)藥物的HPLC-MS/MS分析方法開發(fā)的一般流程：1.查閱相關(guān)文獻資料，了解藥物的理化性質(zhì)，選定內(nèi)標物質(zhì)；2.使用標準品，掃描質(zhì)譜條件；3.選擇色譜柱和流動相，摸索合適的液相條件；4.依據(jù)樣品基質(zhì)，配制模擬生物樣品，選擇相應(yīng)的樣品處理

方法，處理后進樣分析；5.調(diào)整樣品處理方法或液相條件，并可進一步優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)；6.根據(jù)檢測目的，設(shè)定定量范圍，對方法進行考察。本文檔共63頁；當前第45頁；編輯于星期一\16點55分方法學驗證（validation）

生物樣品測定的關(guān)鍵是方法學的確證。方法學確證是整個藥代動力學研究的基礎(chǔ)。這是藥代動力學研究有別于其它藥理毒理研究的特殊之處。所有藥代動力學研究結(jié)果，都依賴于生物樣品的測定，只有可靠的方法才能得出可靠的結(jié)果，因此必須對所建立的方法進行驗證。并且在實際樣品檢測過程中還應(yīng)進行方法學質(zhì)控，制備隨行標準曲線并對質(zhì)控樣品進行測定，以確保檢測方法的可靠性。46本文檔共63頁；當前第46頁；編輯于星期一\16點55分47HPLC-MS/MS方法檢測的的驗證內(nèi)容：1.特異性和靈敏度2.標準曲線和線性范圍3.批內(nèi)精密度和準確度4.批間精密度和準確度5.稀釋效應(yīng)6.定量下限7.回收率

8.基質(zhì)效應(yīng)9.殘留效應(yīng)10.穩(wěn)定性（標準溶液穩(wěn)定性、融解樣品穩(wěn)定性、長期穩(wěn)定性、凍/融循環(huán)穩(wěn)定性、進樣器中樣品穩(wěn)定性等）化學藥物臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則本文檔共63頁；當前第47頁；編輯于星期一\16點55分48Guidelineonbioanalyticalmethodvalidation-EMEA1.選擇性Selectivity考察方法：測定至少六份不同來源的合適的空白生物基質(zhì)結(jié)果要求：在化合物出峰位置，干擾成分的信號大小不

得超過定量下限中分析物信號高度的20%；在

內(nèi)標的出峰位置，雜質(zhì)響應(yīng)不得超過內(nèi)標信

號的5%。本文檔共63頁；當前第48頁；編輯于星期一\16點55分492.殘留效應(yīng)Carry-over考察方法：跟在最高濃度的樣品之后，連續(xù)進樣三遍空

白樣品ULOQ-Blank-ULOQ-Blank-ULOQ-Blank結(jié)果要求：空白樣品中分析物的信號應(yīng)小于定量下限中分

析物信號的20%；內(nèi)標的信號應(yīng)小于5%。本文檔共63頁；當前第49頁；編輯于星期一\16點55分503.定量下限LowerLimitofquantificationLLOQ考察方法：連續(xù)測定六份定量下限濃度的樣品，統(tǒng)計準

確度和精密度結(jié)果要求：準確度應(yīng)在80%-120%之間；精密度結(jié)果小

于20%；同時定量下限處信號響應(yīng)值應(yīng)至少

為空白樣品的5倍。本文檔共63頁；當前第50頁；編輯于星期一\16點55分514.校正曲線Calibrationcurve結(jié)果要求：

校正曲線應(yīng)至少包括六個濃度點以及一個MatrixBlank和一個ControlZero點（僅作參考，不納入校正曲線的計算），必要時可以做雙份測定；各個濃度點的準確度應(yīng)在85%-115%之間，精密度應(yīng)小于15%，定量下限處為80%-120%和20%；對不符合要求的濃度點可以排除計算，但至少有75%以上的濃度點符合要求；方法驗證期間應(yīng)至少提供三條以上的合格的標準曲線納入統(tǒng)計。本文檔共63頁；當前第51頁；編輯于星期一\16點55分525.準確度Accuracy考察方法：測定四個濃度的QC樣品，分別為LLOQ，lowQC，mediumQC，highQC，每個濃度至少測定5份；結(jié)果要求：批內(nèi)：每個濃度QC樣品測定結(jié)果的均值應(yīng)在理論

濃度的85%-115%之間，LLOQ處在80%-120%之間；

批間：至少兩天測定至少三批QC樣品，每個濃度QC樣品測定結(jié)果的總平均值應(yīng)在理論濃度的85%-115%之間，LLOQ處在80%-120%之間。本文檔共63頁；當前第52頁；編輯于星期一\16點55分53質(zhì)控樣品QualityControl，QC將標準品加入到生物基質(zhì)中配制成的模擬生物樣品，用作方法學驗證中的考察樣品和樣品測定中的方法學質(zhì)控。低濃度質(zhì)控(LowQC)濃度不超過LLOQ的3倍；中間濃度質(zhì)控(MediumQC)濃度一般為定量范圍的中間濃度；高濃度質(zhì)控(HighQC)濃度至少為ULOQ的75%。質(zhì)控樣品推薦由獨立人員一次性配制，進樣分析合格后分裝，冰凍儲存，每次取足夠數(shù)量的樣品使用，剩余丟棄。本文檔共63頁；當前第53頁；編輯于星期一\16點55分546.精密度Precision

考察方法：測定四個濃度的QC樣品，分別為LLOQ，lowQC，mediumQC，highQC，每個濃度至少測定5份；結(jié)果要求：批內(nèi)：統(tǒng)計每個濃度QC樣品測定結(jié)果間的CV%值

應(yīng)小于15%，LLOQ處小于20%；

批間：統(tǒng)計每個濃度所有QC樣品測定結(jié)果間的CV%值應(yīng)小于15%，LLOQ處小于20%。本文檔共63頁；當前第54頁；編輯于星期一\16點55分557.稀釋完整性Dilutionintegrity考察方法：將5倍于ULOQ濃度的QC樣品，使用空白基質(zhì)連

續(xù)稀釋。每個濃度單獨稀釋，至少測定5份樣品；結(jié)果要求：每個稀釋濃度的準確度偏差和精密度應(yīng)在15%

之內(nèi)。本文檔共63頁；當前第55頁；編輯于星期一\16點55分568.穩(wěn)定性Stability8.1分析物和內(nèi)標的標準貯備液(Stock)和標準工作液(Working)的穩(wěn)定性8.2樣品冰凍/融三次解穩(wěn)定性，F(xiàn)reeze/Thaw，F(xiàn)/T8.3樣品融解后短期穩(wěn)定性，Thawed8.4樣品冰凍的長期穩(wěn)定性，Long-term8.5處理后樣品溶液在進樣器中的穩(wěn)定性本文檔共63頁；當前第56頁；編輯于星期一\16點55分57穩(wěn)定性考察內(nèi)容和操作主要是根據(jù)樣品的實際儲存條件設(shè)計，所考察的凍/融循環(huán)數(shù)和儲存時間均應(yīng)相等或超過實際樣品。標準溶液穩(wěn)定性考察應(yīng)將stocksolution稀釋至合適的濃度范圍之內(nèi)，結(jié)果新/舊兩份標準溶液的Diff%值應(yīng)在±5%之內(nèi)。樣品的穩(wěn)定性應(yīng)使用Low和High濃度的QC樣品進行考察，每個濃度測定三份，結(jié)果的均值與理論濃度的DEV%值應(yīng)在±15%之內(nèi)。本文檔共63頁；當前第57頁；編輯于星期一\16點55分589.基質(zhì)效應(yīng)Matrixeffect考察方法：在LQC和HQC兩個濃度基礎(chǔ)上，取至少6份不

同來源的空白生物基質(zhì)，提取后加入標準和內(nèi)

標溶