。。--可編輯修改-熒光定量PCR〔一〕一、根本步驟：1、目的基因〔DNAmRNA〕的查找和比對；2、引物、探針的設計；3、引物探針的合成；4、反響體系的配制；5、反響條件的設定；6、反響體系和條件的優(yōu)化；7、熒光曲線和數據分析；8、標準品的制備；二、技術關鍵：1、目的基因〔DNAmRNA〕的查找和比對；從“:///網點的“:///網點的genbank種：一為翻開某個序列后，直接點擊“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再翻開DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊“file”菜單中的“import”，翻開后點擊“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq“filopenentrezsequenc.seq然后要對全部的序列進展排序。用DNAstar軟件中的Seqmansequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的全部文件，點擊“add”或“addall”，然后點擊“Done”導入要比較的序列，再點擊“assemble”進展比較。橫線的上列為全都性序列，全部(contigpercentage”80contig“reassemblecontig”即可。選擇凹凸的原則是在保證所分析的序列在一個“contig”內的前提下，盡量提高“minimummathpercentage”的值。有時因此個別序列緣由，會消滅重復序列，堿基的缺失或插入，要對“contig性最好的排列。然后，點擊“save”保存即可。分析時，主要是觀看是否全部為全都性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不行用的。2、引物和探針設計引物設計細心地進展引物設計是PCR可以增加特異性的引物所具有的令人滿足的特點：序列選取應在基因的保守區(qū)段；擴增片段長度依據技術的不同有所分別：sybrgreenITaqman50bp－150bp；避開引物自身或與引物之間形成44避開引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡構造；182424核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。Tm55－65℃，GC40%－60%；引物之間的TM相差避開超過2℃；3’端避開使用堿基A；3’33為避開基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。Taqman探針設計一般設計原則：探針位置盡可能地靠近上游引物；－70%。探針的5’端應避開使用堿基G。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G為確保引物探針的特異性，最好將設計好的序列在blast中核實一次，假設覺察有非特異性互補區(qū)，建議重設計引物探針。“:///BLAST)“(/BLAST)TaqmanMGB探針設計介紹MGBMGB(14-20bp)，更簡潔找到全部排序序列的較短片段的保守區(qū)。(14-20bpMGBTm值將提高1Tm值的要求。MGB5GG滅基團的熒光信號。用primerexpress軟件評價TmTm65-67℃。盡量縮短TaqmanMGB13bp。盡量避開消滅重復的堿基，尤其是G44個以上的G原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產生熒光信號)。因此，在進展SNP檢測時，為了檢測到突變子，即TaqmanMGB1/343’端3’端2個堿基的前方(即必需確保探針的后兩個堿基是確定的保守)，以進展SNP檢測。反過來，假設要進展同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產生熒光信號。另一種方法是設計簡并探針，也可到達即使是突變，仍可檢測到突變。實時多重PCR多重實時PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標記探針，目的片段，反響中參加SYBRNTm多重實時PCRTaqman探針、或同時為MGBBeacon在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析:設計好各對引物和探針后，重在用DNAstarPrimerselect一文件中的多重PCR計的多重探針后，在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告知此對引物有多少個dimerdGdGdG3、影響PCR及熒光PCR的其他因素引物的設計和選擇符合熒光PCR的探針并進展設計對于實時熒光PCR合理的設計意味著確定的失敗。但是，好的設計并不等于好的試驗結果，影響PCR和熒光PCR引物退火溫度引物的一個重要參數是熔解溫度〔Tm〕。這是當50DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在抱負狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以削減非特異性結合。合理的退火溫度從5570℃。退火溫度一般設定比引物的Tm5℃。TmTm分析法——從序列一級構造和相鄰堿基的特性推測引物的雜交穩(wěn)定性oligo動計算引物的Tm值。在設置退火溫度時可以如下進展：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會削減引物二聚體和非特異性TmTm差異假設超過5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。假設兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm5℃。或者為了提高特異性，可以在依據較高Tm5個循環(huán)，然后再依據較低Tm為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的局部拷貝。引物濃度0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm〔OD260〕測量光密度值。然后使用光吸取值和微摩消光系數的倒數〔nmol/OD〕，通過Beers法則〔公式1〕計算引物濃度。2DNA物的準確濃度必需使用計算的消光系數。這是由于引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數〔OD/μmol〕和消光系數的倒數〔μmol/OD〕。一般商業(yè)合成的引物以O.D20O.D.100ul50pmol/ul〔50μM〕OLIGO系數〔OD/μmol〕，計算出肯定的工作濃度下，引物的加水量。濃度(μM)＝A260〔OD/ml〕×稀釋系數×消光系數的倒數〔nmol/OD〕舉例：計算某寡核苷酸〔1ml〕，10μl100〔990μl〕水中。在A2600.24.8nmol/OD，代入得：濃度＝0.2〔OD/ml〕×100×4.8〔nmol/OD〕＝96nmol/ml＝96μM3.3引物、探針的純度和穩(wěn)定性3.3引物、探針的純度和穩(wěn)定性定制引物的標準純度對于大多數PCR中的任何非全長序列。這些截斷序列的產生是由于DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環(huán)過程，在每個堿基參加時使用重復化學反響，使DNA從3”到5”合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶100μM。也可以用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依靠于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶TE-206〔1530℃〕1干粉引物可以在-201〔15℃30℃〕2探針即寡核苷酸進展熒光基團的標記探針標記效率和純度有很大的區(qū)分。由于反復凍融易導致探針降解，在確認探針質量好的狀況下，最好稀釋成2uM〔10×〕，作為工作濃度分裝多支，避光保存。3.4熱啟動PCRPCRTaqDNA72℃，PCR一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點由于遺傳元件的定位而受限時，如定點突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制TaqDNAPCRPCR一種根本成分延遲DNAPCRTaqDNA。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。Transitor?HotStartTransitor?HotStartTaq酶對于自動熱啟動PCRTransitor?HotStartTaq是在常規(guī)Taq酶的根底上進展了化學修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR修飾集團會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴增的進展，酶活會被逐步釋放，有效提高擴增效率及產物量。Transitor?HotStartTaqDNA95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反響中，從而完全恢復聚合酶活性。3.5鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最正確的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μMdNTP的實時定量PCR，使用35mM〔一般PCR1.5mM〕。較高的游離鎂離子濃度可以增加PCR1mM3mM，0.5mMTransitor?HotStartTaqTransitor?HotStartTaqDNATaqDNA廣的鎂離子濃度范圍內保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。模板質量模板的質量會影響產量。DNAPCR。一些在標準基因組DNASDS0.01DNA的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基質結合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應留意進展PCR反響的模板質量，以增加PCR反響的成功率。模板濃度起始模板的量對于獲得高產量很重要。對大多數PCR擴增和熒光PCR104106〔或在溴化乙錠染色膠上觀看到〔下表〕。舉例說，100ng1μg3×1043×105PCRDNA比較小，因此參加到PCRDNApg10－100ng做一個梯度稀釋，對于定量PCR表1.基因組大小和分子數目的比例基因組DNASize(bp)*TargetMolecules/μg基因組DNASize(bp)*TargetMolecules/μgofGenomicDNAAmountofDNA(μg)for-10^5MoleculesE.coli4.7×10^61.8×10^80.001Saccharomycescerevisiae2.0×10^74.5×10^70.01Arabidopsisthaliana7.0×10^71.3×10^70.01Drosophilamelanogaster1.6×10^86.6×10^50.5Homosapiens2.8×10^93.2×10^51.0Xenopuslaevis2.9×10^93.1×10^51.01.0Musmusculus3.3×10^92.7×10^51.0Zeamays1.5×10^106.0×10^42.0pUC18plasmidDNA2.69×10^33.4×10^111×10^(-6)3.83.8防止剩余〔Carry-over〕污染PCR易受污染的影響，由于它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板為剩余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA〔非剩余污染〕。可以在PCR過程中使用良好的試驗步驟削減剩余污染eppendorfPCR手套。總是使用不含有模板的陰性比照檢測污染。使用預先混合的反響成分，而不是每個反響的每個試劑單獨參加。一種防止剩余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶〔UDG〕。這種酶〔也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG〕移除DNA中的尿嘧啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產物同模板DNAUDG敏感，全部可以在PCRUDG熒光定量熒光定量PCR〔二〕1、高產量，特異和敏捷的定量PCR影響PCR定因素是使用優(yōu)質牢靠的產品。使用優(yōu)質、性能牢靠的熱啟動酶、優(yōu)質的dNTP、MgUNG/dUTPPCR以下步驟的預備：設計引物和探針、合成引物和探針、正確貯存、得到高質量的模板，隨后，您僅需要進展退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的試驗結果。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕同競爭對手的定量PCRPCR您所寵愛的擴增條件，檢測方法和設備。實時定量PCR是快速增長的PCRFQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕是一種便利使用的反響混合液，為定量分析進展了優(yōu)化。它包含了熒光PCR〔如緩沖液，dNTP，聚合酶〕。只需參加您的模板，擴增引物和熒光標記探針。您就可以得到實時qPCR您可以利用成套的hotstartTaq酶kit(A2023A0106)，來配制不含有UNG/dUTP統(tǒng)的熱啟動熒光PCR您也可以選擇hotstartTaq，UNGdNTPS,來配制含有UNG/dUTP動熒光PCR您可以從試驗角度得到多種選擇，得到高產量、特異和敏捷的定量PCR試劑體系！高產量和特異性的擴增FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕PCR用的TaqDNA您得到較高產量，并增加特異性。整合的UDG〔尿苷酸DNA糖基化酶〕防止剩余污染的力量防止了非模板DNA在產量和靈敏度方面，QuantitativePCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕的靈敏度極高〔閾循環(huán)高度敏捷性除了靈敏度和特異性外，UniversalPCR高度敏捷性除了靈敏度和特異性外，UniversalPCRMasterMixKit在分析設置，檢測方法和設備上給您供給了較高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit，您可以：對擴增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于供給了附加的氯化鎂，所以您可以便利地配置Mix體系。可以更敏捷的進展一般PCR和熒光PCR。ABIPrism?7700,ABIGeneAmp?5700Bio-RadI-Cycler。可以利用多種檢測方法的優(yōu)點，包括TaqMan?探針和MolecularBeacon，您不必局限于特定的試劑盒。您還可以敏捷的選擇進展自配熒光PCR體系，不管是含UNG/dUTP防污染系統(tǒng)還是不含該系統(tǒng)的。2、反響體系配制：2、反響體系配制：A2023A0101試劑盒：〔探針體系〕FQ-PCRMasterMix-UNG(2X)25ul〔1×〕；上游引物〔50~900nM〕〔200nM〕，下游引物〔50~900nM〕〔可200nM〕；探針〔200nM〕；待檢樣品5ul〔10~100ng〕；無菌去離子水補足，使總體積到達50ul。您可以選擇熒光染料SYBGREEN20-50ulA2023A0106試劑盒:反響體系終濃度(自配熱啟動熒光系統(tǒng))：1-2U的hotstartTaq3-5.5mM的Mg20.2mM的dNTP、×PCRbuffe〔A2023A010；50－900nM〔200nM〕50－900nM〔200nM〕200nM2-5ul20－50ul自配熱啟動熒光－UNG體系：1-2UTaq1×PCRbuffer、2.5-4.0mMMg2+〔A2023A0105〕；0.2-1UUNG(A2023A0107)〔可先設為0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP〔要調整〕(A2023A0108)；50－900nM的上游引物〔可先設200nM〕、50－900nM的下游引物〔可先200nM〕、200nM2-5ul20－50ul3、反響體系和條件的優(yōu)化:PCRFQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕，優(yōu)化參數最少。您只需要優(yōu)化退火溫度，就可以得到更靈敏、更牢靠的定量結果。對于特別構造的熒光PCR，您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結果。使用通用PCRMasterMix試劑盒進展反響體系的配制，可以適合更多的反響體系，如mRNA的一般RT-PCR檢測，適用于合成質粒的PCR，同時也適用于熒光PCR，范圍更寬。承受成套的hotstartTaq酶kit(A2023A0106)，該試劑盒中含有進展熱啟動熒光核心試劑1、您需要對酶量和鎂離子濃度進展優(yōu)化。酶的推舉反響濃度為1.25－1.5U〔50ul〕，必1-2UMg離子推舉濃度一般PCR1－3mM,熒光PCR3－5.5mM，請在該范圍內探討最正確條件。2、試劑盒中供給的dNTPPCRdNTP0.2mM3200nM50nM－900nM之間進展探討。4、如選用Taqman200nM，不須探討。選擇其他種類的探針需依據要求設置探針濃度。5火溫度，退火時間和循環(huán)數。6、DNA100ng