DNA基本技術2第一節(jié)

核酸印跡技術與分子雜交NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization什么是核酸分子雜交

核酸分子雜交（nucleotidemolecularhybridization）以DNA的變性、復性為理論基礎指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過復性處理后，形成異源雙鏈的過程一、Southern印跡可用于分析基因

拷貝數(shù)的變化由E.M.Southern在1975年提出可用于分析基因拷貝數(shù)的變化基本操作過程包括待測DNA樣品的制備和基因探針的標記；待測DNA樣品的電泳分離；電泳分離的DNA經(jīng)變性、轉移、固定到合適的固相支持物；特異性核酸探針與膜上DNA片段雜交，放射自顯影或顯色檢測目的DNA的存在。

Southern印跡分析基本流程濾紙NC膜凝膠濾紙電泳 轉移雜交，顯影酶切DNA樣品上樣 DNA印跡重物緩沖液二、Northern印跡和RT-PCR可用于

分析基因轉錄水平的變化Northernblot是將RNA從凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上，定性分析mRNA的常用方法；RT-PCR是以mRNA為模板反轉錄合成cDNA、再以cDNA為模板進行特異性擴增，進行RNA定性或定量分析的一種方法；二者均可用于分析基因轉錄水平的變化。三、原位分子雜交技術可用于基因及其表達產(chǎn)物的定位分析原位雜交（insituhybridization，ISH）即利用分子雜交技術來進行基因及其表達產(chǎn)物定位分析的一種技術；可用于基因及其表達產(chǎn)物的定位分析。8FISH箭頭所示為雜交信號，結合帶型分析可判斷染色體位置第二節(jié)

聚合酶鏈式反應PolymeraseChainReaction什么是聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）是一種在體外特異地擴增已知基因的方法；由K.Mullis于1983年建立；可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化；可進行實時、定量分析；可結合免疫沉淀的方法確定蛋白質與DNA序列的相互作用。

PCR技術的工作原理5`3`3`5`5`3`3`5`++5`5`變性、退火引物5`3`3`5`+5`5`dNTPsTaqDNA聚合酶不同長度新鏈DNA循環(huán)1+引物變性、退火25～30次循環(huán)后，模板DNA得到擴增5`3`3`5`+5`3`3`5`++5`3`3`5`+5`3`3`5`++dNTP TaqDNA聚合酶均一長度新鏈DNA循環(huán)2一、PCR技術分析基因及其產(chǎn)物反轉錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）是將RNA的反轉錄反應和PCR反應聯(lián)合應用的一種技術。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。mRNA5AAAAAA(n)3mRNA5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5mRNA5cDNA3AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5oligo(dT)12-18反轉錄酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTT(n)5AAAAAA(n)3TTTTTT(n)5反轉錄合成cDNA二、PCR技術可以進行實時、

定量分析QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標記引物RQ3'3'5'5'三、PCR結合免疫沉淀擴增與蛋白質

結合的DNA序列第三節(jié)

DNA序列測定DNASequencing*DNA序列分析方法的演變和發(fā)展20世紀70年代雙脫氧鏈終止法：F.Sanger化學裂解法：A.Maxam和W.Gilbert20世紀80年代PCR及自動測序技術一、DNA序列分析有雙脫氧鏈終止法和

化學裂解法

（一）Sanger雙脫氧鏈終止法利用2′，3′-雙脫氧核苷酸摻入中（二）Maxam-Gilbert化學裂解法利用化學試劑裂解修飾堿基止聚合反應

雙脫氧鏈終止法GATC

測序反應

電泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5'

3'

正極負極ddGddAddTddCDNA序列自動分析ddG紅ddTddA綠ddC藍橙毛細管電泳熒光標記DNA合成測序結果展示二、DNA序列分析可以揭示基因和

基因組一級結構變化通過DNA序列分析可以鑒定基因和基因組的變異通過DNA序列測定分析人工重組的基因通過DNA序列測定對定點突變進行確認第四節(jié)

DNA芯片技術DNAChipTechnologies什么是DNA芯片技術DNA芯片（DNAchip）在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探針，與待測熒光標記樣品進行雜交；通過對雜交信號的檢測、比較和分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達)；亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。基因芯片工作流程一、利用DNA芯片技術可同時進行高通量基因轉錄活性的分析cDNA芯片每個探針是cDNA片段或基因的一段PCR產(chǎn)物，可以同任何具有同源序列的樣品形成雜交體，同時定量監(jiān)測大量基因的表達。寡核苷酸芯片利用基因特異的寡核苷酸片段為探針，每個基因有10~20個相對應的探針，對低豐度基因表達水平變化的檢測具有高度靈敏性。二、染色質免疫共沉淀與芯片技術結合檢測蛋白質-DNA相互作用染色質免疫共沉淀-芯片（chromatinimmunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip）特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，解交聯(lián)后對目的片段進行純化、擴增和熒光標記，再用于芯片分析；尋找特異性蛋白在基因組中的結合位點，獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。ChIP-on-chip工作原理第五節(jié)

酵母及哺乳動物細胞雜交系統(tǒng)YeastandMammalianHybridSystems一、酵母雙雜交探測蛋白-蛋白的相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）由S.Fields和O.Song于1989年提出并初步建立酵母雙雜交技術的基本原理二、酵母單雜交系統(tǒng)需要構建“報告”細胞酵母單雜交技術（yeastone-hybrid）由J.Li于1993年從酵母雙雜交技術發(fā)展而來是體外分析DNA與細胞內(nèi)蛋白質相互作用的一種方法；通過對酵母細胞內(nèi)報告基因表達狀況的分析，鑒別DNA結合位點并發(fā)現(xiàn)潛在的結合蛋白基因。酵母單雜交技術的基本原理三、蛋白質-RNA相互作用也可采用酵母三雜交系統(tǒng)進行分析酵母三雜交系統(tǒng)（yeastthree-hybridsystem）于