資料內容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯系改正或者刪除。細胞工程:按照一定的設計方案,經過在細胞、亞細胞或組織水平上進行實驗操作,獲得重構的細胞、組織、器官以及個體,創造優良品種和產品的綜合性生物工程。一、無菌操作1、無菌操作時注意事項:1、點燃酒精燈,所有操作均在火焰近處并經過燒灼進行;2、冷卻后才能使用;3、操作時,打開試管蓋,進行燒灼滅菌,可是時間要短。在火焰上燒瓶口。保證容器傾斜。4、進行操作時動作要準確敏捷,可是不宜太快,防止空氣流動,增加污染的機會;5、超凈工作臺上的器具和用品要擺放合理。6、操作時器具不能觸及瓶口以防止污染;7、不要說話;8、接種時在近火焰處打開瓶口,使瓶傾斜,以免空氣中微生物落入瓶中9、整個接種操作應在近火焰處進行,且動作要迅速10、防止操作帶來的污染接種過程中盡可能達到懸空要求11、接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口12、瓶蓋朝上放,接種完畢后立即蓋好瓶口;13、接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產生。14、種子和分生組織培養時一般將其貼放在培養基表面,,以保證供氧充分。15、接種植株莖段時注意形態學下端插入培養基內,而形態學上端露于空氣中.16.污染材料應及時清除,高壓滅菌。2、無菌室1.要求:密封、防塵、防菌,2.結構:更衣間、緩沖間、操作間,3.空氣消毒:紫外燈或無臭氧紫外線消毒器,4.操作:在超凈工作臺上.(超凈工作臺,側流式:垂直式,氣流由左側或右側經過工作臺面流向對側,也有從上向下或從下向上流向對側。有擋板。外流式:水平式,凈化的空氣面向操作者流動,多為開放式,沒有防護擋板,易污染。)二、動物細胞工程1.細胞貼壁率:細胞貼壁率又稱接種存活率,用于觀察貼壁附著生長細胞,主要反映細胞的生存能力和部分底物材料的相容性。2、細胞周期:也稱細胞分裂周期,是指一個細胞經生長、分裂增殖成兩個細胞所經歷的全過程。3、細胞系:由原代培養產生的能進行無限次傳代培養的細胞群。4、細胞株:是指從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或經過篩選的的方法,由單細胞增殖形成的細胞群。5、接觸抑制:是體外培養中某些貼附型細胞生長特性之一。一般情況下,正常的細胞不停頓地活動或移動,其外周的細胞膜呈現一些特征性皺褶樣活動。可是,當兩個細胞由于移動而互相靠近發生接觸時,細胞不再移動,在接觸區域的細胞膜皺褶樣活動停止,從而使細胞停止運動。這種由細胞接觸而抑制細胞運動的現象稱為接觸抑制6、密度抑制:細胞接觸匯合成片后,雖發生接觸抑制,但只要營養充分,細胞依然能夠進行增殖分裂,數量仍在增多。可是當細胞密度進一步增大,培養液中營養成分減少,代謝產物增多時,細胞因營養的枯竭和代謝物的影響,則發生密度抑制,導致細胞分裂停止7、雜交瘤:將免疫動物B細胞核骨髓瘤細胞融合,得到的融合細胞稱之為雜交瘤。單克隆抗體技術也稱雜交瘤技術.細胞融合:又稱體細胞雜交,是指兩個或更多個相同或不同細胞經過膜融合形成單細胞的過程。常見方法有仙臺病毒法、聚乙二醇(PEG)法、電融合法。8、單克隆抗體:經過免疫的哺乳動物單一的B淋巴細胞能夠分泌單一抗體,這種具有特異性的、同質性的抗體為單克隆抗體。9、干細胞:是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。10、干細胞有幾個主要特征(1)干細胞本身不是終末分化細胞;(2)干細胞能無限增殖分裂;(3)干細胞可連續分裂幾代,也可在較長時間內處于靜止狀態;(4)干細胞分裂產生的子細胞只能有兩種命運——保持為干細胞或分化為特定細胞。11、胚胎干細胞鑒定:(1)細胞的形態結構(2)核型分析(3)堿性磷酸酶(AKP)染色(4)SSEA-I免疫熒光標記(5)分化能力檢測體外分化試驗、體內分化試驗、嵌合體形成試驗、核移植試驗12、干細胞的分類:(1)根據分化潛能大小分:全能干細胞:它具有形成完整個體的分化潛能。如受精卵,胚胎干細胞。多能干細胞:具有分化出多種組織細胞的潛能,但卻失去了發育成完整個體的能力,發育潛能受到一定的限制。專能干細胞:這類干細胞只能向一種類型或密切相關的兩種類型的細胞分化。(2)根據來源來分:來源于胚胎---胚胎干細胞ESC、胚胎性生殖細胞EGC來源于組織---組織干細胞STDSC三、轉基因動物1.轉基因的概念:將特定的目的基因從某一生物體分離出來,進行擴增和加工,再導入另一動物的早期胚胎細胞中,使其整合到宿主動物的染色體上,在動物的發育過程中表示,并經過生殖細胞傳給后代。轉基因動物(transgenicanimal)是指借助基因工程技術將外源基因導入受體動物染色體內,外源基因與動物基因整合后隨細胞的分裂而擴增,在體內表示并能穩定地遺傳給后代的動物。2.技術方法:反轉錄病毒法、基因顯微注射法、胚胎干細胞移植法3.轉基因動物研究存在的問題:(1)轉基因動物的低效性(2)轉入基因造成宿主基因突變問題(3)轉入基因的表示問題(4)病毒轉基因研究存在的問題(5)轉基因動物模型與預期不符問題(6)乳腺生物反應器的問題(7)社會問題4.動物乳腺生物反應器存在的問題(1)外源基因在動物體內的位點整合問題(2)乳蛋白基因表示組織特異性問題(3)目的蛋白的翻譯后修飾問題(4)轉基因表示產物的分離和純化問題(5)轉基因的技術與方法問題(6)倫理道德問題.5.動物乳腺生物反應器:一般把目的片段在器官或組織中表示的轉基因動物叫動物生物反應器。動物乳腺生物反應器利用哺乳動物乳腺特異性表示的啟動子元件構建轉基因動物,指導外源基因在乳腺中表示,并從轉基因動物的乳液中獲取重組蛋白。6.動物乳腺生物反應器的制備:(1)表示載體的構建當前用于表示載體的啟動子調控元件選用動物乳蛋白基因啟動子元件,主要有四類乳腺定位表示調控元件:第一類是B2乳球蛋白(BLG),第二類是酪蛋白基因調控序列:第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調控序列;第四類是乳清白蛋白基因調控序列。(2)目的基因的選擇選擇目的基因的基本要求是,正常情況下濃度低、翻譯后修飾復雜、其它表示體系難以表示或表示量低、應用前景廣闊的蛋白基因。(3)體外重組選擇好目的基因和啟動子調控元件后進行體外重組,構建融合基因。(4)基因轉導將構建好的重組基因用基因轉導方法轉移到受精卵。(5)胚胎移植利用胚胎移植技術將制備的轉基因受精卵植入待孕母體子宮內,生產轉基因動物,得到轉基因乳腺表示個體。經過采集轉基因動物的乳汁,來獲得目的基因表示產物。(6)鑒定轉基因動物乳腺生物反應器能夠從分子水平和乳腺分泌物兩個方面進行鑒定。四、胚胎工程1.概念:胚胎工程(embryotechnology)或發育工程(developmentaltechnology):在胚胎移植技術上發展起來的現代生物技術。包括胚胎發育過程中的卵子切割、性別控制、嵌合體制作、細胞核轉移、轉基因操作等定向控制、改造和創新遺傳性狀的技術。2.技術方法:體外受精、胚胎移植、胚胎分割與融合、胚胎性別鑒定、胚胎冷凍技術、基因導入3.體外受精:哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環境中完成受精過程的技術。原理:在體外人工模擬體內環境,包括營養、溫度、濕度、氣體、滲透壓、pH等,使初級卵母細胞成熟,同時使精子獲能,完成受精。體外受精技術主要包括以下幾個主要方面:精子的采集與獲能、卵子的回收及成熟培養、體外受精、受精卵的體外發育及試管胚胎的移植等。(1)常規體外受精技術將獲能精子與成熟卵子置于受精液中共同培養,使之完成受精過程。一般情況下,受精液與獲能液為同一種液體。(2)與分離精子相結合的體外受精技術將精子分離技術與體外受精技術結合起來生產預選性別的優良胚胎,對加速家畜品種改良和畜牧業生產具有重要的應用價值。(3)顯微受精技術為了提高體外受精的成功率,借助顯微操作儀將精子直接注入卵母細胞質或透明帶下,完成受精過程。顯微受精技術避免了由透明帶或卵質膜所形成的受精障礙,使受精率和準確率大大提高。體外受精的意義:家畜體外受精技術經過近20年的發展,已取得很大進步,為實現動物胚胎的工廠化生產提供了可能,對充分發揮良種母畜的繁殖潛力,加快家畜品種改良和優良品種遺傳資源的開發與利用,加速畜牧業的發展具有重要的科學意義和實用價值。3.試管嬰兒:體外受精結合胚胎移植技術,分別將卵子和精子取出后體外受精,發育成胚胎后在植回母體子宮內發育、出生獲得嬰兒的技術。1978年7月26日4.超排技術:超數排卵:人為注射外源促性腺激素,促使卵巢排出較正常情況下更多的成熟卵子。當前常見的方法是利用孕馬血清促性腺激素5.體外篩選卵細胞的標準:根據卵母細胞的形態規則,細胞質均勻程度及外圍有卵丘細胞包圍情況,常把未成熟卵母細胞分為A、B、C和D四個等級。五。、細胞核移植技術核移植技術:所謂核移植技術就是利用顯微操作技術將一個細胞的細胞核移植到另一個細胞中,或者將兩個細胞的細胞核(或細胞質)進行交換,從而可能創造無性雜交生物新品種的一項技術。核移植克隆哺乳動物的技術操作過程主要包括核受體和核供體的處理和制備、核移植、重組胚的體外或體內培養、核移植胚胎移入代孕母畜(寄母)等步驟。1．核受體細胞的準備去核卵母細胞常常作為核移植的受體細胞。這是因為在卵母細胞的細胞質含有某種特定的因子,能夠使移植核中所含有的基因表示程序發生重新排列,使已經分化了的細胞重新回到發育過程的原點,同受精卵一樣開始個體發育過程。卵母細胞的來源有兩種方式:一是用激素對雌體進行超排處理,從輸卵管沖出體內成熟的MⅡ卵母細胞。二是從屠宰場收集卵巢,吸出濾泡中的卵丘—卵母細胞復合體(COCs),在體外培養成熟后作為受體。2．核供體細胞的準備在核移植操作中,細胞核供體細胞首先必須是完整的二倍體,該細胞必須保持有供體動物完整的基因組;其次,供體細胞核必須能夠在受體細胞質的作用下,產生細胞分化過程的倒轉,變得如同剛剛受精的合子一樣,能重新完成從受精到發育成一個正常動物個體的全過程。供體細胞主要有兩大類:胚胎卵裂球和體細胞。另外,核供體細胞的來源還有胚胎干細胞和胎兒成纖維細胞。3．細胞核移植常見的核移植方法有兩種,即胞質內注射和透明帶下注射。胞質內注射是用一個外徑5～8μm的注核針吸取供體核后直接注射進卵母細胞胞質內的方法。透明帶下注射則是把供體細胞核注射在透明帶與卵母細胞之間的卵周隙中,核移植后用電刺激進行細胞融合。4．激活卵母細胞的激活涉及的因素很多,無論是受精引起的卵母細胞激活還是人工的激活,都會引起卵母細胞發生一系列的反應,這些反應是胚胎發育所必須的。其激活原理是經過電刺激、鈣離子載體等方法,使卵母細胞從MII期中解放出來,并轉到”受精”的狀態。5．重組胚的體內或體外培養經融合和激活的重組胚移入中間受體作體內或體外培養,觀察重組胚的發育率。羊、牛、豬的核移植胚常采用體內培養方法獲得桑椹胚和囊胚,即羊和牛的重組胚用瓊脂包埋后移入休情期的母羊結扎的輸卵管中體內培養4-7d,發育至桑椹胚和囊胚。豬的核移植重組胚移入同期化受體母豬輸卵管內作體內培養7d,發育為囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作體外培養,發育至桑椹胚或囊胚。6．胚胎移植重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強、體格稍大的當地品種,進行同期發情處理,按常規方法移植代孕母畜(寄母)的子宮中,待其發育到產仔。六、植物細胞工程1.幾個重要概念:?外植體:植物組織培養中用來進行離體無菌培養的離體材料,器官、組織、原生質體。?愈傷組織:由外植體組織脫分化形成的結構疏松顏色淺而透明細胞分裂速度快的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。?原代培養:初次培養,是從供體獲取組織后的首次培養。是建立各種細胞系的第一步.?傳代培養:體外培養的細胞隨著培養時間的延長,細胞數量會不斷增加,當增長到一定程度后,由于發生接觸性抑制或培養空間及營養物質的消耗,其生長會逐漸減慢,甚至停止及死亡。細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶的過程稱之為傳代培養。?繼代培養:愈傷組織在培養基上生長造成營養物枯竭、水分散失,積累了代謝產物,將組織轉移到新培養基上培養稱繼代培養?植物組織培養是在含有營養物質及植物生長物質的培養基中,培養離體植物組織并誘導使其長成完整植株的技術。2.植物組織培養分類:(根據外植體不同)(1)胚胎培養(2)器官培養(3)組織培養(4)原生質體培養3.技術方法:(1)培養材料的清洗(2)消毒(3)接種和培養(4)根/芽的誘導(5)組培苗的練苗移栽?接種的步驟:1)、將植物組織塊消毒;2)、清洗;3)、取出并置于一個已經滅過菌的培養皿中;4)、使用消過毒的器械切取適當的外植體;5)、將培養容器的蓋或塞子打開,將外植體接種到培養基上。6)、封口7)、溫度:25℃;或隨材料而定8)4.植物的快繁和脫毒:利用組織培養技術,將優良植株的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細胞進行離體培養,在短期內獲得大量遺傳性一致的植株的技術稱為植物快速繁殖技術。?優點:(1)數量大、速度快;(2)能夠使苗木繁殖不受大自然的干擾,形成育苗的工廠化。(3)具有方法簡便,繁殖迅速,其遺傳組成完全一致,遺傳性比較穩定,易保持植株的優良性狀的優點,在基礎理論研究和實際應用中具有重要價值?流程:(1)無菌苗制備:在無菌條件下,用試管內繼代增殖的植物材料,或者從植物體上分離的植物材料首先進行表面滅菌,然后在無菌的條件下切割成帶一兩個芽的莖段,接種在特定培養基上,誘導不定芽的形成。如果培養基合適,在每個芽眼處會形成多個芽體,稱為叢芽。(2)不定芽增殖(快繁的主要階段)?腋芽途徑:有的植物具有大量腋芽,由于頂端優勢效應,這些腋芽的生長在整體植株上被頂芽抑制。若將腋芽分離下來,給以適當的培養條件,即可形成大量的不定芽,不定芽進而再生為植株。此途徑不但繁殖率高,同時能保持該植物種的遺傳穩定;?器官發生途徑:從器官外植體誘導不定芽,再生成植株。不定芽能夠直接來源于外植體或經過從繼代的愈傷組織、不定根、外植體或愈傷組織產生的休眠器官(如小鱗莖、小球莖、小塊莖);?胚狀體途徑:又稱體細胞胚發生途徑,由植物組織和細胞培養直接發生類胚結構,最后以胚狀體成苗的方式獲得無菌母株。(3)完整植株的形成;生根培養基中誘導根的分化和根系的形成,最終成為具有根、芽的完整植株。(4)再生植株的鍛煉和馴化;循序漸進的原則。日光、濕度鍛煉;(5)再生植株的鑒定:培養變異的產生,應及時去除。植物形態學、細胞學鑒定。?植物脫毒方法:微莖尖培養法:當前最常見的脫毒方法:珠心組織培養法,熱處理法。?脫毒苗的鑒定:1)、外觀判斷法:帶病毒植物往往葉片發黃、凹凸不平、畸形,可根據這些表現來判斷。但有些病毒表現不明顯,僅靠這一方法還不夠。2)、指示植物法:適合鑒定靠液汁傳染的病毒。將被檢測植物的液汁涂抹在指示植物的葉片上,根據發病情況,判斷脫毒植物是否還帶有病毒以及濃度。指示植物對病毒反應敏感,容易接種。一般不同病毒應選用不同植物。常見指示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、辣椒等。3)、電子顯微鏡檢查法:直接觀察,檢查有無病毒存在,并根據病毒的大小、形狀和結構等判斷病毒種類。方法先進,但需設備和技術。?培育脫毒苗的意義:(1)、培育脫毒苗能夠滿足農作物和園藝植物發展的需要,脫除嚴重患病毒植物的病毒,恢復種性,提高產量質量(2)、脫毒苗的培育,在植物病理學上也有重要意義。豐富了病理學的內容,從過去消極的砍伐病枝,銷毀病株,到病株的脫毒再生,是一個積極有效的途徑,且對綠色產品開發,減少污染,保護環境,增進健康,都有長遠意義。?植物快速繁殖和試管苗工廠化生產中的注意事項:1、污染:導致早期培養失敗、增殖效率降低、生長減慢、生長不均勻等。2、植物材料的預處理目的是獲得比較清潔的材料,并改變母株、外植體的生理狀態,有利于其體外生長和分化.預處理包括光照、溫度、生長調節物質。3、變異的控制.?分生組織之因此能避開病毒侵染,可能有5方面原因:(1)、能量競爭:植物細胞分裂時和病毒核酸DNA合成均需要消耗大量的能量,而分生組織細胞本身很活躍,其DNA合成是自我提供能量自我復制,而病毒核酸的合成要靠植物提供能量來自我復制,因為得不到足夠的能量,從而就抑制了病毒核酸的復制。(2)、傳導抑制:在植物體中,病毒的移動主要靠兩條途徑,一是經過維管系統,而分生組織中尚未形成維管系統;二是經過胞間連絲,但這條途徑病毒移動速度非常緩慢,難以追趕上活躍生長的莖尖和根尖。(3)、激素抑制:在分生組織中存在高水平生長素和細胞分裂素,阻滯了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。(4)、酶缺乏:可能病毒的合成需要的酶系統在分生組織中缺乏或還沒建立,因而病毒無法在分生組織中復制。(5)、抑制因子:1976年Martin－Tangury等提出了抑制因子假說,認為在分生組織中存在某種抑制因子。5.原生質體的提取:植物原生質體的分離包括(1)基礎材料準備(材料用幼嫩的植株、胚性愈傷組織、體細胞胚、懸浮培養細胞等)(2)植物原生質體的分離(機械分離法、酶解分離法纖維素酶,半纖維素酶,果膠酶)(3)原生質體的收集與純化(4)原生質體活力檢測?原生質體培養方法(1)液體淺層培養(2)液體－固體雙層培養(3)固體培養法(4)瓊脂糖珠培養6.植物轉基因的技術方法:植物轉基因技術又稱基因重組技術,即將人工分離和修飾過的基因導入植物基因組中,由于導入基因的表示而引起植物體的性狀的可遺傳的修飾。?植物轉基因技術包括:目的基因的克隆、外源基因的導入和轉基因植物的再生?方法;農桿菌介導轉化法、基因槍介導轉化法7.細胞融合技術:自發融合、誘發融合(1、鹽類融合法2、高鈣高PH融合法3、聚乙二醇融合法/PEG法4、PEG、高鈣高PH相結合的融合法5、電融合)8.人工種子的概念:人工種子(artificialseed):是指經過植物組織培養的方法產生的體細胞胚包埋在含有營養成分和保護功能的物質中,在適宜條件下能夠發芽成苗的植物幼體9.低溫預處理:低溫能明顯提高花粉胚的誘導率。不同材料采用的低溫處理溫度和時間有一定差異。?低溫預處理的作用機理:1)預處理引起花藥、花粉內源激素發生變化,改變了小孢子(花粉粒)第一次有絲分裂的軸向即紡錘體的取向(正常發育時,兩次有絲分裂形成三核花粉粒),由于細胞分裂面的改變,花粉粒的極性分化不起作用,因而形成兩個均等的細胞,這種均等的細胞分裂使花粉朝著形成胚胎的方向發育,進而形成愈傷組織或胚狀體。2)提高小孢子的生活力,延緩退化速度,而提高了誘導率3)引起小孢子孤立化,即小孢子從花藥中分離。因為低溫處理過程中,花藥內薄壁細胞和絨氈層逐漸退化,從而切斷與小孢子之間的聯系。無論哪種機理正確,但結果是預處理能促進花粉啟動,提高誘導率和再生率。10.花粉培養和花藥培養:?花粉培養的精確定義是:將處于一定發育階段的花粉從花藥中分離出來,再加以離體培養。有時花粉培養也稱為小孢子培養(microsporeculture)。從培養方法和技術方面來講,它屬于細胞培養的范疇。?花藥培養其外植體是植物雄性生殖器官的一部分,就培養方法和技術來講,屬于器官培養的范疇。11.單倍體培養:體外單倍體誘導一般是指利用離體培養花藥或小孢子的方法,誘導形成單倍體植株。單倍體育種是指將具有單套染色體的單倍體植物,經人工染色體加倍,使其成為純合二倍體,從中篩選出