抗禽流感病毒M2蛋白單克隆抗體的制備及鑒定【摘要】目的:制備抗禽流感病毒M2蛋白的單克隆抗體并進(jìn)行特性鑒定。方法:利用純化的融合蛋白GSTM2免疫BALB/c小鼠,然后以GSTM2和GST分別作為ELISA抗原進(jìn)行篩選,選擇GSTM2抗原檢測強陽性、GST抗原檢測陰性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆,建立能穩(wěn)定分泌抗AIVM2mAb的雜交瘤細(xì)胞株。mAb的效價采用間接ELISA和瓊脂擴散試驗測定,用夾心ELISA測定Ig亞類,Westernblot、抗原捕獲ELISA、間接免疫熒光及免疫組化染色法檢測mAb的特性。結(jié)果:得到4株分泌抗禽流感病毒M2蛋白的mAb的雜交瘤細(xì)胞株1E1、2F8、4E3和5D6,小鼠腹水中抗體的ELISA效價大于210×100、AGP效價大于1∶4。抗體亞類鑒定1E1和4E3為IgG2a,2F8和5G6為IgG2b。抗原捕獲ELISA表明,2F8mAb能

與H5、H9亞型AIV發(fā)生特異性反應(yīng),而不能與雞新城疫病毒和雞傳染性法氏囊病毒反應(yīng)。IFA和免疫組化試驗表明,2F8mAb能夠與感染了禽流感病毒的MDCK細(xì)胞以及雞體組織細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)論:本研究獲得4株抗禽流感病毒M2蛋白的mAb,其中2F8mAb的效價高、特異性強,可作為檢測AIV方法的核心試劑。

【關(guān)鍵詞】禽流感病毒M2蛋白單克隆抗體

禽流感病毒的基因組由8個單股RNA片段組成,這種多節(jié)段性的特點決定了基因組除本身易發(fā)生基因突變、小片段基因重組外,還特別易與禽流感病毒、豬流感病毒或人流感病毒等進(jìn)行完整片段的基因重排,因而禽流感病毒亞型眾多,變異性極強[1,2]。自1878年意大利首次報道禽流感發(fā)生以來,禽流感相繼在世界各地暴發(fā),而且不斷出現(xiàn)新的亞型和變異株,以致于1997年香港及2004年南亞地區(qū)發(fā)生了感染人的事件[3,4]。我國自1993年在雞、鴨、鵝、鴿、珍禽中分離到禽流感病毒以來,雞群中已存在H9、H5、H7及H14等多個血清亞型,給我國養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成極大威脅。因此加強禽流感疫情監(jiān)測工作特別重要,尤其是定期、持續(xù)、監(jiān)測和及時、準(zhǔn)確的預(yù)測預(yù)報,只有如此,才能將禽流感尤其是高致病力禽流感消滅在萌芽狀態(tài)。2002年,秦愛建等報道,利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗AIV的H5和H9亞型血凝素特異性的單克隆抗體(mAb),并建立了診斷高致病性毒株H5和低致病性H9亞型病毒的方法,使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。盡管如此,只能對在一定時期內(nèi)發(fā)生特

定亞型禽流感病毒感染時具有鑒定作用,無法對可能發(fā)生的新變種的禽流感病毒感染做出診斷。因此研究一種可廣泛檢測禽流感病毒的方法,對提高人們在疫情預(yù)測預(yù)報方面的能力很有幫助。

M2蛋白是禽流感病毒中高度保守的蛋白,它在禽流感病毒各亞型的不同毒株之間都具有很高的同源性,因此可用于所有禽流感的診斷中[6,7]。本研究中,我們利用獲得的高度純化的融合蛋白GSTM2作為免疫原免疫BALB/c小鼠,然后運用雜交瘤技術(shù),來研制抗禽流感病毒M2蛋白mAb,以期為建立快速準(zhǔn)確診斷禽流感病毒感染的方法奠定基礎(chǔ),進(jìn)而為該病的大流行預(yù)警預(yù)報提供技術(shù)保證,也為及時撲滅和防止疫情的擴散提供科學(xué)依據(jù)。

1材料和方法

材料

8周齡雌性BALB/c小鼠,由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供;骨髓瘤細(xì)胞系Sp2/0由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病教研室提供。

DMEM、HAT、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷均為Invitrogen公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG、弗氏佐劑、HRP標(biāo)記羊抗雞IgG、PEG1450、FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG以及鼠源mAb亞類試劑盒均為Sigma公司產(chǎn)品;優(yōu)級胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。禽流感病毒:AIVA/goose/Guangdong/96(H5N1)、AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)由國家流感中心提供。雞傳染性法氏囊病病毒BJ836株、雞新城

疫病毒LaSota株,抗H9N2、H5N1的AIV,抗IBDV、NDV的SPF雞血清及陰性血清由本研究所保存。

方法

抗原的制備

利用本研究所構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEXM2以及pGEX5X1在大腸

桿菌中BL21誘導(dǎo)表達(dá),獲得的可溶性產(chǎn)物用GlutathineSepharose4B進(jìn)行親和層析得到純化的融合蛋白GSTM2及GST蛋白。融合蛋白GSTM2已被證實保留了天然AIVM2蛋白的免疫原性,可作為本研究的免疫原[8,9]。

動物免疫

首次免疫用弗氏完全佐劑乳化抗原,間隔3周后,采用弗氏不完全佐劑乳化抗原,背部皮下多點注射8周齡BALB/c小鼠,如此

進(jìn)行第3、4次免疫并用ELISA檢測每只小鼠的抗體水平。第4次免疫間隔3周后進(jìn)行加強免疫,每只小鼠腹腔注射不加佐劑的融合蛋白200μg。

加強免疫后3d,選取抗體水平最高的小鼠處死,按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合[10]。

間接ELISA方法建立以及陽性雜交瘤的篩選標(biāo)準(zhǔn)

分別以融合蛋白GSTM2和pGEX空載體菌體蛋白GST包被酶標(biāo)板孔,進(jìn)行平行反應(yīng)。然后分別以1∶1000的免疫小鼠陽性和陰性血清作為一抗,酶標(biāo)羊抗小鼠IgG的工作濃度為1∶5000進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)通過方陣滴定確定抗原最適包被濃度。酶聯(lián)免疫檢測儀測定A490值,以≥且最接近的P/N值的M2融合蛋白抗原和GST的稀釋度來作為以后檢測時的抗原包被濃度。

檢測時,平行設(shè)置GSTM2和GST蛋白包被的酶標(biāo)板孔,吸取雜交瘤細(xì)胞上清2份,相對應(yīng)地分別加到上述2個板孔中,陽性對照為1∶1000的免疫鼠血清,陰性對照為正常小鼠血清。陽性雜交瘤判定標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞上清的A490值在GSTM2包被的板孔中大于陽性血清的A490值,而在GST包被的酶標(biāo)板孔中則小于陰性血清A490值,同時符合上述2個條件的細(xì)胞,確定為可分泌抗M2mAb的雜交瘤細(xì)胞[11]。

細(xì)胞融合和克隆化

按常規(guī)方法,處死免疫鼠,采集血清備用。取小鼠脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。融合劑為500g/L的PEG1450,取BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞,HAT營養(yǎng)液為融合用選擇培養(yǎng)液,融合后分裝于96孔板中,置于37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后更換新鮮HAT營養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)至第8天進(jìn)行第1次檢測篩選,以后改換HT培養(yǎng)液,經(jīng)常觀察,當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長至孔面積的1/4左右時,開始篩選、檢測。

將M2融合蛋白抗原檢測陽性、GST抗原檢測陰性的雜交瘤細(xì)胞按有限稀釋法進(jìn)行3次克隆,挑選反應(yīng)性較強的克隆化細(xì)胞移至24孔板擴大培養(yǎng),作為建株細(xì)胞。

小鼠腹水的制備

取500μL高壓滅菌過的液體石臘注射于BALB/c小鼠的腹腔內(nèi),14d后腹腔注射約1×106個雜交瘤細(xì)胞,密切觀察動物的健康狀況與腹水征象,接種細(xì)胞7～10d后產(chǎn)生腹水,待腹水盡可能多,而小鼠瀕于死亡之前,處死小鼠,用滴管將腹水收集到離心管中,

10000r/min離心10min。吸取上清冷凍保存。

mAb效價測定

ELISA效價:用抗原包被酶標(biāo)板,腹水mAb及雜交瘤細(xì)胞上清1∶100稀釋后進(jìn)行2倍系列稀釋,另設(shè)同樣稀釋度陰、陽性血清作為對照,按常規(guī)間接ELISA測其效價。瓊脂擴散效價:按雙向雙擴散試驗進(jìn)行:用g/L生理鹽水配置10g/L瓊脂糖澆注平皿,按常規(guī)方法打孔,抗原稀釋后加于中央孔,周圍孔分別加2倍系列稀釋的mAb腹水,置于濕盒中37℃過夜孵育,觀察沉淀線。

mAb的IgG亞類及輕鏈種類鑒定

用Sigma公司鼠mAb亞類檢測試劑盒進(jìn)行鑒定,即以1∶1000倍稀釋的羊抗鼠亞類二抗包被酶標(biāo)板孔,對各雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行夾心ELISA測定。

mAb特異性的鑒定

Westernblot:以純化的M2融合蛋白及GST為抗原,經(jīng)120g/LSDSPAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)印至醋酸纖維膜上,然后以1∶1000稀釋的mAb腹水作為一抗,1∶8000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行免疫檢測。抗原捕獲ELISA:以包被液將雜交瘤細(xì)胞上清作1∶20稀釋包被酶標(biāo)板,每孔100μL,置37℃溫箱2h后于4℃包被過夜,PBST洗滌3次后,50g/L的脫脂奶封閉2h,再洗滌3次后,以分別從1∶50開始作倍比稀釋的AIV、AIV、NDV、IBDV作為抗原,每孔100μL,37℃作用1h后,洗滌3次,再以用封閉液1∶100稀釋的各病毒相應(yīng)血清作為一抗,1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG作為二抗進(jìn)行ELISA,測定結(jié)合不同病毒的滴度,同時設(shè)無抗原對照。間接免疫熒光:將AIVA/goose/Guangdong/96(H5N1)感染長成單層的MDCK細(xì)胞,待CPE出現(xiàn)“＋”時,用胰酶消化細(xì)胞,PBS重懸細(xì)胞,將細(xì)胞滴到帶孔的玻片上,自然干燥并用冷丙酮固定,制備抗原片。將1∶10稀釋的mAb腹水進(jìn)行2倍系列稀釋后,依次加到抗原片上,37℃孵育30min,PBS洗滌3次,干燥后,加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG,37℃孵育30min,PBS洗滌3次后,熒光顯微鏡下觀察。設(shè)未感染AIV的

MDCK細(xì)胞制備的抗原片為陰性對照。免疫組化:以禽流感病毒于負(fù)壓隔離器中對SPF雞進(jìn)行攻毒,發(fā)病后立即宰殺,并取不同部位的組織進(jìn)行固定,封蠟切片,再以2F8mAb作為一抗進(jìn)行免疫反應(yīng)并染色[12]。

2結(jié)果

陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立

以M2融合蛋白和GST作為抗原分別包被酶標(biāo)板,經(jīng)ELISA的A值相減法篩選,3次陽性克隆后,獲得4株分泌抗M2蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1E1、2F8、4E3、5D2。

mAb的ELISA效價

將4株mAb腹水和混合細(xì)胞上清進(jìn)行倍比稀釋,然后以P/N≥稀釋度的倒數(shù)為ELISA效價;mAb腹水與GSTM2融合蛋白

抗原之間出現(xiàn)沉淀線最大稀釋度的倒數(shù)來確定不同細(xì)胞株的瓊脂擴散效價,結(jié)果具有很高的ELISA效價和一定的AGP效價。表1M2mAb的ELISA和AGP效價

mAb的Ig類及亞類的鑒定

經(jīng)夾心ELISA鑒定獲得的mAb1E1和4E3為IgG2a,2F8和5G6為IgG2b。

mAb特異性的鑒定

Westernblot

純化的GSTM2融合蛋白及GST為抗原,經(jīng)120g/LSDSPAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)印至醋酸纖維膜上后,mAb作為一抗進(jìn)行Westernblot,結(jié)果在DAB顯色后,2F8mAb使GSTM2顯示Mr35000的條帶,而GST則沒有任何顯示。

抗原捕獲ELISA

以2F8雜交瘤細(xì)胞上清包被的夾心ELISA對mAb捕獲病毒檢測結(jié)果表明,mAb捕獲禽流感的效價分別為:H5N1=1∶2560,

H9N2=1∶5120,而mAb和NDV、IBDV不發(fā)生反應(yīng),表明mAb對禽流感病毒的反應(yīng)是特異的。

間接免疫熒光

在熒光顯微鏡下可以觀察到,AIV感染的MDCK細(xì)胞的表面發(fā)出綠色熒光,而細(xì)胞核被伊文氏蘭染成暗紅色,表明mAb腹水能結(jié)合AIV感染的細(xì)胞,而對未感染AIV的細(xì)胞無反應(yīng),整個細(xì)胞在伊文氏蘭染料映襯下發(fā)出紅色光。經(jīng)測定2F8mAb腹水結(jié)合AIV的效價為1∶1000。

免疫組化

對AIV感染的雞脾臟組織切片進(jìn)行過氧化物酶染色,結(jié)果M2mAb能夠結(jié)合脾細(xì)胞質(zhì)中的禽流感病毒,在DAB及蘇木

精的映染下,表現(xiàn)為黃褐色,而對未收到禽流感病毒感染的SPF雞的脾細(xì)胞則不表現(xiàn)結(jié)合現(xiàn)象。

3討論

M2蛋白是A型流感病毒的非糖基化多肽,它不需要任何翻譯后修飾就能成為病毒的抗原成分,因而在原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白具有天然蛋白相同的抗原性,其可作為免疫原制備針對流感病毒M2蛋白表位的mAb[13,14]。Liu等[15]用流感病毒M2膜外區(qū)與GST的融合蛋白制備了M2e的特異性mAb,該mAb能使75%的經(jīng)腹腔注射后的小鼠能夠抵抗5LD50的流感病毒A/PR/8/34的攻擊。在本研究中,我們制備了針對AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)的M2蛋白的mAb,其生物學(xué)特性表明,它既能結(jié)合H9亞型也能結(jié)合H5亞型的禽流感病毒。說明它不僅可以應(yīng)用到禽流感的診斷中,而且也可能交叉保護(hù)方面起作用。

為獲得針對M2蛋白的mAb,我們克隆了AIVA/chicken/Guangdong/00(H9N2)的M2基因,然后將缺失跨膜區(qū)的M2基因在大腸桿菌中獲得可溶性表達(dá)并制備了高度純化的GSTM2融合蛋白[8,9],然后以此為免疫原來制備mAb。在進(jìn)行陽性克隆細(xì)胞株篩選時,必須去除針對GST等大腸桿菌成分產(chǎn)生的陽性抗體的干擾。為此,研究者特地設(shè)計了ELISA的A值相減法篩選。即將同一孔的細(xì)胞上清平行作2個抗原包被的ELISA,然后選擇GSTM2融合蛋白抗原檢測強陽性、GST抗原檢測陰性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆篩選,這樣不僅完全篩除分泌抗GSTmAb的雜交瘤細(xì)胞,而且還

能有效地避免不完全純化產(chǎn)生的假陽性克隆。

Westernblot結(jié)果表明,本研究中獲得的mAb2F8,不僅是針對M2蛋白特異性的抗體,還具有M2線性表位,說明它將在未來禽流感病毒的M2基因各種表達(dá)科研鑒定工作中起作用。經(jīng)過夾心ELISA捕獲抗原試驗和間接免疫熒光試驗表明,我們制備的該M2mAb不僅對尿囊液中的AIV有特異性結(jié)合作用,而且還可結(jié)合AIV感染的MDCK細(xì)胞。在MDCK細(xì)胞的免疫熒光照片中可以看出,AIV表達(dá)的M2蛋白呈現(xiàn)在細(xì)胞膜的表面,這和以前有關(guān)M2的報道是一致的[16],說明我們制備的M2mAb可用于AIVM2蛋白細(xì)胞定位的研究。

本研究中,我們制備的M2mAb2F8對感染細(xì)胞的AIV的結(jié)合有較好的敏感性,表明了它有希望應(yīng)用到日后建立禽流感病原檢測方法中。此mAb能夠結(jié)合雞脾臟細(xì)胞中的禽流感病毒的結(jié)果進(jìn)一步表明,它將在禽流感病理學(xué)的診斷工作發(fā)揮重要作用。

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