淺論改良組織塊法培養細針活檢滑膜組織成纖維樣滑膜細胞【摘要】【目的】探討體外分離培養細針活檢滑膜組織成纖維樣滑膜細胞(FLS)的方法。【方法】滑膜組織來自接受盲式細針滑膜活檢術的活動期類風濕關節炎患者，分別采用消化酶培養法、組織塊培養法和改良組織塊培養法分離培養FLS。采用臺盼藍染色進行細胞計數及活性鑒定，并應用倒置相差顯微鏡、透射電鏡、免疫細胞化學染色、流式細胞術對第3～4代FLS進行鑒定。【結果】3種原代分離培養的方法均可成功培養出FLS。臺盼藍染色示FLS細胞計數約(±)×105/瓶，活細胞百分率95%。傳代可使FLS達到形態學上的純化要求，倒置相差顯微鏡、透射電鏡觀察均符合FLS的形態結構特征，免疫細胞化學染色示Vimentin陽性、CD68陰性、CK陽性，流式細胞術檢測示CD55+細胞占(±)%。改良組織塊法培養FLS成功率較高，細胞游出時間較早，所需傳代時間較短。【結論】改良組織塊法特別適合于細針滑膜活檢標本FLS的培養，第3～4代細胞的數目、活性及純度符合進一步實驗的要求。

【關鍵詞】成纖維樣滑膜細胞;細胞培養;細針活檢

Abstract：【Objective】Toexploretheculturemethodforfibroblast-likesynoviocytes(FLS)fromneedlebiopsiedsynoviumtissue.【Methods】Synoviumtissueobtainedfrompatientswithactiverheumatoidarthritisbyblindneedlesynoviumbiopsywereculturedwiththreedifferentmethods(digestiveenzymeculture，tissuecultureandmodifiedtissueculture).Cellcountandthepercentageofviablecellswereobservedbytrypanbluestaining.FLSwereidentifiedbymorphology，immunocytochemicalstainingandflowcytometry.【Results】AllthreemethodscouldcultureFLSsuccessfully，ofwhichmodifiedtissueculturemethodwasbetterthantheothertwomethods.FLScellcountwas(±)×105perflaskwithmorethan95%viablecellsbyTrypanbluestaining.FLSofthethirdorforthgenerationshowedtypicalmorphologicalcharactersunderinvertedphasecontrastmicroscopeandtransmissionelectronmicroscopewithVimentin+/CD68-/CK+stainingand(±)%CD55+cells.Modifiedtissueculturemethodhashighersuccessfulratewithearlierandmorequicklycellemigrationfromsynoviumtissue.【Conclusion】ModifiedtissueculturemethodisespeciallysuitableforFLScultureinvitrofromneedlebiopsiedsynoviumtissue.Thecellcount，thepercentageofviablecells，andpurityofFLSofthethirdorforthgenerationmeettherequirementformolecularbiologyexperiments.

類風濕關節炎(rheumatoidarthritis，RA)是以關節滑膜炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病，滑膜細胞增生并向周圍組織侵襲形成血管翳在RA的發病、慢性炎癥的維持及骨與軟骨的破壞中起重要作用。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-likesynoviocyte，FLS)是滑膜組織最活躍的組成細胞，可通過自分泌或旁分泌方式產生大量的炎性細胞因子及免疫反應介質，是參與RA發病的重要細胞[1]。FLS體外培養模型的建立對于研究FLS的功能、進一步探討RA的發病機制及體外篩選治療RA的藥物具有重要意義。目前用于FLS體外培養的滑膜多來自關節開放性手術、關節鏡手術、從滑液中分離及細針滑膜活檢等方法，其中細針滑膜活檢局麻下操作，技術簡單，并且獲取的滑膜組織常較少混有其它成分，有利于原代細胞培養的純化和操作。然而，細針活檢獲取的滑膜組織體積較小，標本總量較開放手術少，若采用經典的消化酶培養法或組織塊培養法進行原代培養，成功率偏低，細胞生長速度緩慢。為此，本實驗探討細針活檢滑膜組織FLS體外培養的最佳方法，為有效進行下一步實驗做準備。

1材料與方法

材料

滑膜組織

來自接受盲式細針滑膜活檢術的確診活動期RA患者，RA診斷符合1987年美國風濕病協會(AmericanCollegeofRheumatology，ACR)修訂的診斷標準。

主要試劑

DMEM/F12培養基、胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)、g/L胰酶-g/LEDTA(美國GIBCO公司);I型膠原酶、PBS緩沖液、臺盼藍(廣州威佳生物有限公司);鼠抗人Vimentin單克隆抗體、鼠抗人CD68單克隆抗體、生物素化羊抗鼠IgG、DAB反應顯色試劑盒(武漢博士德公司)、鼠抗人CK單克隆抗體(北京中杉)、鼠抗人CD55單克隆抗體(BDPharmingen公司)。

方法

消化酶培養法

①將活檢的滑膜組織剪碎，加入I型膠原酶(1mg/mL)并充分混勻，置37℃、體積分數5%CO2細胞培養箱中消化4～6h;②用100目細胞濾網過濾、離心，棄上清，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養液重懸細胞，移入細胞培養瓶中培養;③每2～4d更換一次含100mL/LFBS的DMEM/F12培養液。

組織塊培養法

①將活檢的滑膜組織剪成1mm3大小，以5mm間距均勻排列在培養瓶的培養面，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養液，使培養面斜向上置細胞培養箱;②孵育4h待組織塊貼附后，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養;③每2～4d更換一次含100mL/LFBS的DMEM/F12培養液。待組織塊周圍FLS成片生長后，去除組織塊繼續培養。

改良組織塊培養法

①將活檢的滑膜組織剪成1mm3大小，加入I型膠原酶并充分混勻，置細胞培養箱中消化4～6h;②細胞濾網過濾、離心，棄上清，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養液重懸細胞，移入細胞培養瓶中培養;③收集細胞濾網上的組織碎屑，以5mm間距均勻排列在另一培養瓶的培養面，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養液4mL及I型膠原酶1mL，使培養面斜向上置細胞培養箱;④孵育4h待組織塊貼附后，將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養;⑤24h后更換含100mL/LFBS的DMEM/F12培養液，以后每2～4d更換一次培養液，待FLS成片生長后，去除組織塊繼續培養。

FLS的傳代培養

待細胞長至融合度約70%～80%時進行細胞傳代，g/L胰酶-g/LEDTA消化，待細胞突起逐漸收縮、細胞變圓、細胞間距增大時終止消化，離心后按1：3進行傳代培養。

臺盼藍染色FLS計數及活性鑒定

將第3～4代FLS消化離心重懸后，取等體積細胞懸液和5g/L的臺盼藍染液混勻，靜置染色3～4min后計數。死細胞被染成淡藍色，活細胞拒染。根據以下公式進行細胞計數：細胞總數/毫升=(4大格細胞總數/4)×104×稀釋倍數。活細胞百分率(細胞活性)=(4大格活細胞總數/4大格細胞總數)×100%。

倒置相差顯微鏡

觀察細胞原代及傳代后的形態及生長狀況。

透射電鏡

第3～4代細胞細胞消化離心后，25g/L戊二醛、20g/L多聚甲醛混合液前固定，10g/L鋨酸后固定，乙醇、丙酮梯度脫水，Epon包埋劑包埋，超薄切片，乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染，PhilipsCM10透射電鏡觀察。

Vimentin、CD68、CK免疫細胞化學染色

將第3～4代細胞爬片用40g/L多聚甲醛液固定，加一抗(鼠抗人Vimentin單克隆抗體、鼠抗人CD68單克隆抗體、鼠抗人CK單克隆抗體，1∶100稀釋)、加生物素化羊抗小鼠IgG，DAB顯色，蘇木素輕度復染，乙醇梯度脫水，中性樹膠封片。PBS作為陰性對照。

流式細胞術檢測CD55+細胞百分率

第3～4代細胞經消化重懸制成1×105/mL的單細胞懸液，加入鼠抗人CD55單克隆抗體進行免疫熒光染色，流式細胞術檢測細胞表面CD55表達并計算其陽性率。

2結果

三種體外培養FLS方法的比較

共行24例次細胞培養，其中消化酶培養法10次，成功6次;組織塊培養法5次，成功4次;改良組織塊法9次，成功9次。采用消化酶培養法，FLS約24h貼壁，初期生長較慢，約2周長滿瓶底20%～30%，之后生長較快，約4周長滿瓶底的70%～80%(圖1)。采用組織塊培養法，2～3d可見長梭型FLS從組織塊邊緣游走生長，并逐漸增多呈放射狀，兩周后細胞迅速生長，約3～4周長滿瓶底的70%～80%(圖2)。采用改良組織塊培養法，分為2瓶原代細胞，1瓶為膠原酶所消化下來的細胞，其生長速度與消化酶法相近;另1瓶為組織塊，1～2d后見長梭型FLS從組織塊邊緣游走生長，并逐漸增多呈放射狀，1周后細胞迅速生長，約2～3周長滿瓶底的70%～80%(圖3)。

FLS計數及活性鑒定

3種方法培養出的FLS長滿25cm2培養瓶時細胞總數為(±)×105/瓶，活細胞百分率95%。

FLS的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察可見FLS呈三角形、梭形，細胞核成卵圓形，位于細胞中央，核仁清晰，細胞周圍可見分泌物聚集。Vimentin、CD68、CK免疫細胞化學染色結果顯示第3～4代FLSVimentin染色陽性，胞漿內見大量棕黃色顆粒，CD68染色陰性，CK染色陽性，胞漿可見棕黃色顆粒(圖4)。透射電鏡下觀察可見FLS核染色質較疏松，呈細顆粒狀分布在核周圍，核仁明顯，粗面內質網豐富，胞漿突起長而粗，胞漿中往往缺乏高爾基復合體，可見少量小泡和囊泡(圖5)。流式細胞術檢測3～4代FLSCD55+細胞百分率為(±)%(圖6)。

3討論

滑膜包括襯里層和襯里下層，襯里層主要有巨噬樣滑膜細胞和FLS，襯里下層為結締組織，RA尤其是病程長的患者其滑膜襯里下層含較多的纖維組織。FLS在慢性炎癥過程中被激活后，出現細胞表型的顯著改變，具有不完全轉化細胞的特性，即使脫離炎癥環境仍持續活化，增殖能力升高，逃脫接觸抑制，呈現腫瘤樣增殖，并具有侵襲能力。FLS體外培養模型的建立對于研究包括RA在內的多種滑膜關節病變的發病機制具有重要意義。

目前用于FLS體外培養的滑膜多來自關節開放性手術、關節鏡手術、從滑液中分離及細針滑膜活檢等方法。前兩種方法所獲取的滑膜組織較大，采用消化酶培養法或組織塊培養法往往都能成功培養出FLS[5-6]。然而，開放手術對患者的創傷大，多用于晚期RA患者，切取的滑膜組織可能混有較多其它組織成分;關節鏡手術則實現了可視下滑膜活檢，是目前獲取滑膜標本的“金標準”，但需專門設備、價格昂貴、技術難度高。從滑液中分離得到的滑膜或滑膜細胞數量有限，且脫落至關節腔的滑膜或滑膜細胞的生物學特性可能與關節表面的滑膜或滑膜細胞的生物學特性不完全一致。細針滑膜活檢術操作安全、簡便，成功率高，可用于早中期的RA患者。本實驗采用盲式細針滑膜活檢術獲取滑膜組織，其體積往往較小，滑膜組織數量不如關節開放性手術及關節鏡手術多。因此利用這種細針活檢滑膜組織進行FLS體外培較困難。

經典的細胞原代培養包括消化酶培養法和組織塊培養法。消化酶培養法屬于化學法，需要的滑膜標本量較多，且消化酶活性不夠穩定，不利于有效消化分離滑膜纖維組織，細胞不易游離出來，加上所用的消化酶對細胞有一定的毒性，因此該方法FLS體外培養的成功率不高，細胞生長速度緩慢。組織塊培養法雖然適合滑膜標本量較少的情況，細胞生長可定位觀察，換液次數少，減少了污染的機會，但種植的組織塊不易成活，簇狀方式長出的細胞時間間隔較長，細胞生長緩慢。我們根據細針活檢滑膜組織的特點，對上述傳統的方法進行了改良，將消化酶法及組織塊培養法有機地結合起來，既具有組織塊培養法的優點，又避免了消化酶培養法的缺點，尤其適合滑膜標本量較少時。

在FLS體外分離培養過程中，可能同時混雜巨噬樣滑膜細胞以及少量的內皮細胞、樹突狀細胞等。巨噬樣滑膜細胞(A型滑膜細胞)呈卵圓形，胞周有短突起，核仁清晰;內皮細胞光鏡下呈三角形或梭形，長滿時呈鋪路卵石狀排列;樹突狀細胞多為懸浮，光鏡下細胞體積較大，形狀不規則，并且有毛刺狀突起，這三種細胞的形態學及生長特性與FLS有差異。研究顯示，第一代的滑膜細胞中約40%～50%為巨噬樣滑膜細胞，50%～60%為FLS，而第三代則99%以上為均一的FLS[10]。這主要是由于巨噬樣滑膜細胞不具有增殖能力，隨著培養時間的延長，細胞漸漸衰老至失去活性，在體外僅可存活約10d[11]。FLS在含100mL/LFBS的DMEM培養液中培養的分裂增殖迅速，呈長梭狀極向排列，能以傳代培養的方式在體外培養較長時間。因此用自然純化、酶消化及反復貼壁傳代相結合對細胞進行分離和純化，可逐步獲得較純的FLS。

分離純化FLS之后還必須對其進行鑒定，包括形態學和細胞表面標記物的檢測。值得注意的是細胞表面標記物的檢測。FLS較特異的細胞表面標記有UDPGD、VCAM-1/CD106、DAF/CD55、鈣粘蛋白-11(Cadherin-11)、Vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羥化酶、CD44等[12]，其中Vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羥化酶是各種成纖維細胞的標記，而UDPGD、VCAM-1/CD106、DAF/CD55是襯里層FLS的特異標記。其中CD55為補體衰退加速因子(DAF)，在與血液接觸的細胞中都有低表達，而在組織空腔襯里的間充質細胞、濾泡狀樹突狀細胞有高表達[13]，在關節腔滑膜組織中FLS也有較高的表達，可與其它成纖維細胞相鑒別。CD68是巨噬細胞的表面標志，巨噬樣滑膜細胞陽性表達。

另外，本實驗分離培養的FLS還可能同時混雜襯里下層的纖維母細胞或成纖維細胞。襯里層的FLS具有上皮樣表型如E-Cadherin的表達[14]，而襯里下層的纖維母細胞或成纖維細胞來源于間充質細胞，Vimentin陽性而不表達DAF/CD55，說明襯里層和襯里下層的成纖維樣細胞亞群之間表型及功能不同[15]。新近研究發現，RA滑膜襯里層的FLS不但具有成纖維細胞形態，而且具有不依賴支持物生長、細胞連接粘附分子消失、Vimentin表達增高等間充質細胞特點，表明RA-FLS存在上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)[16]。EMT不僅可能是RA-FLS大量增多的原因之一，而且還可能與RA滑膜浸潤破壞軟骨有關[14，16]。本文體外分離純化的細胞通過細胞表面標記檢測發現其Vimentin、DAF/CD55、CK均陽性，CD68陰性，表明分離純化的細胞為襯里層同時具有上皮和間充質細胞特點的FLS而不是襯里下層僅有間充質細胞表型特點的纖維母細胞或成纖維樣細胞。

本實驗對RA滑膜體外培養的第3～4代細胞行形態學及細胞表面標記檢測，結果顯示，培養出的細胞為FLS，純度95%。由于第1～2代FLS的純度不夠，而第5代之后的FLS出現老化現象，增殖活性明顯降低，細胞形態變化較大，至第8代完全失去增殖活性，因此采用第3～4代FLS進行后續實驗。

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