激光掃描共聚焦顯微鏡研究生演示文稿當前第1頁\共有79頁\編于星期三\6點激光掃描共聚焦顯微鏡研究生當前第2頁\共有79頁\編于星期三\6點

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）

當前第3頁\共有79頁\編于星期三\6點

授課內容

一、LSCM的發展與現狀

二、LSCM的成像原理及組成

三、LSCM的使用步驟四、LSCM的基本功能

五、LSCM在生物醫學領域中的應用當前第4頁\共有79頁\編于星期三\6點

1957年，MarvinMinsky提出共聚焦原理；1978年，Brandengoff在高數值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度的共聚焦顯微鏡；1982年，BIO-RAD公司第一個推出商品化激光掃描共聚焦顯微鏡；

1985年，WijnaendtsVanResandt發表了第一篇有關激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學中應用的文章；1987年，發展成現在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。一、激光掃描共聚焦顯微鏡發展與現狀當前第5頁\共有79頁\編于星期三\6點儀器名稱生產商型號BD高通量活細胞共聚焦分析系統400系列

美國BD公司

Pathway415、Pathway435

BD高通量活細胞共聚焦分析系統800系列

美國BD公司

800系列

BD全光譜活細胞共聚焦高速掃描系統

美國BD公司

CARVⅡ

尼康共焦顯微鏡

尼康（Nikon)

C1

共焦激光掃描顯微鏡

徠卡儀器有限公司Leica

TCS-SP2

OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡

OLYMPUS

FV300

OLYMPUS激光共聚焦顯微鏡

OLYMPUS

FV1000

NIKON共聚焦顯微鏡

尼康（nikon)

尼康（nikon）C1-plus

UltraView?高速掃描型激光共聚集系統

PerkinElmer

UltraView?

高通量共聚焦顯徽細胞圖像分析測定系統

GEHealthcare

INCellAnalyzer3000

時間分辨激光共聚焦顯微成像系統

德國耶萊公司

TauMap

德國ZEISS激光共聚焦顯微鏡

德國ZEISS

LSM510SYSTEM

德國ZEISS激光共聚焦顯微鏡

德國ZEISS

LSM510PASCALSYSTEM

當前第6頁\共有79頁\編于星期三\6點FluoView?FV1000共聚焦顯微鏡

FV1000系統完美地整合了兩套相互獨立的掃描模塊在一套系統內，在一束激光進行實驗刺激的同時，另一束激光實時地對樣品進行掃描，從而記錄完整的動態變化過程。

美國Meridian公司的ACASuLTIMA312為同類儀器中檔次最高、功能最全的精密儀器。它能達到每秒120幅畫面的高速掃描激光共聚焦觀察，可提供實時，真彩色的激光共聚焦原色圖象。

BIO-RAD公司第七代Radiance

2100型激光掃描共聚焦顯微鏡是全世界唯一無需人工調整的激光掃描共聚焦掃描顯微鏡

當前第7頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第8頁\共有79頁\編于星期三\6點

1）激光光源

2）計算機系統

3）共聚焦系統4）光學探測系統

5）圖像分辨率

6）掃描方式激光掃描共聚焦顯微鏡硬件和軟件系統硬件系統軟件系統1）、ImageAnalyze2）、RatioAnalysis和Kinetics3）、Cell–CellCommunicationandFRAP4）、CellList5）、CellSorting6）、ConfocalImaging當前第9頁\共有79頁\編于星期三\6點Mitoticcells,multiplefluorescence(NCIMaryland)

當前第10頁\共有79頁\編于星期三\6點

激光掃描共聚焦顯微鏡（LaserScanningConfocalMicroscopy，簡稱LSCM）是近代生物醫學圖象儀器的最重要發展之一，它是在熒光顯微鏡成象的基礎上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發熒光探針，利用計算機進行圖象處理，從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖象，以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化等。已廣泛應用于細胞生物學、生理學、病理學、解剖學、胚胎學、免疫學和神經生物學等領域，對生物樣品進行定性、定量、定時和定位研究具有很大的優越性，成為這些領域新一代強有力的研究工具。

二、激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理及組成當前第11頁\共有79頁\編于星期三\6點1、LSCM的基本結構

熒光顯微鏡系統及樣品臺

激光光源掃描器圖象存儲及處理系統

LSCM各部分相互關系示意圖

計算機控制系統

控制

當前第12頁\共有79頁\編于星期三\6點共聚焦顯微鏡與普通光學顯微鏡的比較

計算機數字圖象處理分析系統普通光學顯微鏡場光源干擾激光掃描共聚焦顯微鏡激光光源共軛聚焦原理和裝置照相當前第13頁\共有79頁\編于星期三\6點LightMicroscopy

AC.elegansEmbryoGatpro-nucleimeetingGstage(beforedividinginto2-cellembryo)

DifferentialInterferenceContrast

(DIC;Nomarski)LaserScanningConfocalMicroscopy(LSCM)MultiphotonFluorescenceExcitationMicroscopy(MPFE)當前第14頁\共有79頁\編于星期三\6點2、LSCM的工作原理激光束掃描器接收器計算機載物臺的升降“光學切片”

“細胞CT”

當前第15頁\共有79頁\編于星期三\6點

LSCM組成光路的示意圖

當前第16頁\共有79頁\編于星期三\6點

Beampathintheconfocallaserscanningmicroscope

當前第17頁\共有79頁\編于星期三\6點共聚焦原理示意圖當前第18頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第19頁\共有79頁\編于星期三\6點（一）激光光源

（1）、激光譜線（2）、激光器開閉和電壓調節（3）、激光強度回饋穩定電路設計（4）、輔助設備當前第20頁\共有79頁\編于星期三\6點波長（nm）功率(mW)激光器類型32510～30氦鎘(He-Cd)激光351300帶紫外的水冷式氬離子激光364>20風冷氬離子激光（Ar-ion）44211氦鎘激光457～51425小型氬離子激光5431.25綠氦－氖(He-Ne)激光63033外諧振器半導體激光6303碰撞脈沖染料激光6323.5氦－氖激光700～11002000藍寶石激光11521氦－氖激光當前第21頁\共有79頁\編于星期三\6點（二）掃描器

掃描器針孔光欄（pinhole）分光鏡發射熒光分色鏡檢測器當前第22頁\共有79頁\編于星期三\6點1）針孔光欄2）分光鏡作用位置位置作用當前第23頁\共有79頁\編于星期三\6點3）發射熒光分色鏡4）檢測器位置作用位置作用當前第24頁\共有79頁\編于星期三\6點光束掃描臺階掃描掃描方式

原理優缺點當前第25頁\共有79頁\編于星期三\6點激光共聚焦顯微鏡的基本結構當前第26頁\共有79頁\編于星期三\6點掃描系統

（1）、激光掃描系統通過照相通道或熒光通道和顯微鏡相連，與所接顯微鏡一體化設計（2）、檢測器數量（3）、共聚焦針孔（4）、掃描分辨率及灰度級（5）、連續分光設計系統（或其它光譜分離系統）50-300微米（6）、光譜掃描功能（7）、掃描速度及速度調節當前第27頁\共有79頁\編于星期三\6點（8）、掃描方式XYZtλ任意組合

①點掃描②線掃描③Xλ掃描④平面掃描⑤XYλ、XZλ掃描⑥xyz,xyzt掃描⑦局部放大掃描⑧光譜模式下，多通道同時掃描。（9）、掃描旋轉、光學放大（變倍）（10）、可即時或延時進行掃描（11）、有線和幀方式的多重掃描功能ROI(regionofinteresting，感興趣區域）實時（realtime）顯示當前第28頁\共有79頁\編于星期三\6點（12）、在改變掃描分辨率及掃描速度等后，無須很復雜地對儀器參數重新設置（13）、有記憶功能（14）、有專用的圖象數據庫（15）、系統采用模塊化設計，便于整個系統的擴展和升級換代當前第29頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第30頁\共有79頁\編于星期三\6點Drosophilaembryo,brain,3DProjection-"extendeddepthoffocus“(Prof.Reichert,LaborNeurobiologieUniversityofBasel)當前第31頁\共有79頁\編于星期三\6點（三）光學系統（顯微鏡）⑴、倒置熒光萬能顯微鏡⑵、顯微鏡上的外接接口⑶、熒光顯微鏡的載物臺上裝有微量步進馬達⑷、熒光鏡座要裝有防振動裝置⑸、裝有光路轉換裝置⑹、配備高數值孔徑的油浸或水浸物鏡⑺、載物臺支架和附件的配置當前第32頁\共有79頁\編于星期三\6點(10)、≥4位顯微鏡熒光濾色片組，置換方便，覆蓋紫外和可見光波長⑼、熒光顯微鏡的參數要與光路系統、計算機控制軟件系統相匹配⑻、汞燈光線的強度可調當前第33頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第34頁\共有79頁\編于星期三\6點

熒光源

單光子激勵（左），多光子激勵（右）激發熒光能量圖當前第35頁\共有79頁\編于星期三\6點單光子（λ1）單光子（λ2）雙光子（λ2）單、雙光子激發產生熒光過程的示意圖

熒光熒光當前第36頁\共有79頁\編于星期三\6點

熒光光譜

當前第37頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第38頁\共有79頁\編于星期三\6點

分隔發射的熒光

當前第39頁\共有79頁\編于星期三\6點

Separationoffluorescenceemissionsbymeansofdichroicfilters當前第40頁\共有79頁\編于星期三\6點（四）計算機系統控制硬件的軟件功能：

①控制電動顯微鏡；②選擇激光波長，調節激光強度；③拍攝2-5維圖像；④選擇光譜拍攝范圍，分辨率，激發光擋片位置。當前第41頁\共有79頁\編于星期三\6點應用軟件功能（圖象處理、數據分析、生物學應用等）：①多通道疊加，三維重建，旋轉，生成AVI文件，Average拍攝模式提高信噪比；②熒光強度動態分析，動態顯示，Ratio值測量（鈣離子等）；③FRAP/FLIP；④線性光譜拆分，自定義染料光譜數據庫，背景扣除；⑤圖像調節亮度，對比度，Gamma；單個通道分別調節或多個通道同時調節；⑥圖像處理：旋轉，裁剪，多種濾鏡（Kirsh/Laplace/Lowpass/Median），添加標尺，箭頭，文字等；⑦圖像分析：直方圖，距離，強度，強度斷面分布；⑧VBA模塊：宏功能，可以錄制，編輯，回放，實現自動操作；⑨多種視圖：1D，2D，正交視圖，圖片疊加等；⑩光譜分析具有多種方式選擇，支持盲法拆分，方便用戶使用；⑾具有專業的FRAP（熒光漂白），FRET（熒光能量共振轉移）軟件包。

當前第42頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第43頁\共有79頁\編于星期三\6點三、激光掃描共聚焦顯微鏡的使用步驟（一）樣品制備

1．組織切片標本實驗標本要求單層，并能很好地貼附在樣品池中。所以，組織標本無論是石蠟切片還是冰凍切片，均為越薄越好。2．細胞標本細胞種類和純度，細胞密度和形態。3．承載細胞的器皿Petri皿和玻片。當前第44頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第45頁\共有79頁\編于星期三\6點（二）熒光探針的選擇標記生物樣品的探針大約分為：1）蛋白質、單糖和多糖探針；2）細胞器探針；3）核酸探針；4）細胞活性探針；5）膜和受體探針；6）細胞膜電位和細胞內pH探針；7）金屬探針；8）分子的特殊基團結合探針；9）其他當前第46頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第47頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第48頁\共有79頁\編于星期三\6點（4）、按軟件要求設置有關參數，進行觀察和分析。（三）儀器使用步驟（1）、選擇激光器類型（2）、選擇相應的濾片（3）、根據實驗目的選擇適當軟件當前第49頁\共有79頁\編于星期三\6點Xy觀察模式的圖象獲得設置染色方法顯微鏡和掃描的配置設置物鏡放大率設置變焦率為1x設置所需通道設置最高掃描速度設置xy觀察模式執行重復掃描校正對于確定z位置觀察所需復合的各部分條件設置觀察范圍校正圖象亮度設置較低的掃描速度重新校正圖象亮度停止重復掃描獲得圖象儲存圖象當前第50頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第51頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第52頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第53頁\共有79頁\編于星期三\6點1）DNA用Hoechst33342標記（藍），2）細胞膜用NBD-PC染色（綠），3）線粒體用Mitotracker標記（紅）三重熒光染色圖譜：活HT細胞當前第54頁\共有79頁\編于星期三\6點1、“更多信號！”

1）、通過減慢掃描速度2）、使用“平均”方法3）、增加發射濾鏡的帶寬4）、加大針孔直徑；注意：光學切片的厚度也會相應地增大。5）、增大激發能（激光功率）；注意：漂白效應、飽和效應和光毒效應。如何改善圖像質量當前第55頁\共有79頁\編于星期三\6點3、“更可靠！”

1）、使用多軌2）、提供預定義配置。3）、可同時定義和使用任何形狀的多個研究區。2、“更多細節！”

1）、使用較高數值孔徑(NA)的物鏡2）、增加“幀大小”=每條線的像素值+每幀的線條數3）、優化掃描焦距(Z)4）、增加動態范圍當前第56頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第57頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第58頁\共有79頁\編于星期三\6點Culturedcells,multiplefluorescence(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)Cellculture,3Dshadowprojection(calculatedby"Imaris",BitplaneAG,Zürich)showingtightjunctions(red)andcytoskeletonstructures(green)(Prof.Wunderli-Allenspach,ETHZürich)當前第59頁\共有79頁\編于星期三\6點四、激光掃描共聚焦顯微鏡的基本功能

主要功能

采集圖像定量測定相關參數熒光信號定性定位觀察當前第60頁\共有79頁\編于星期三\6點（一）采集和處理圖像

1、無損傷逐層掃描樣品采集二維及三維熒光圖像LSCM的成像特點：（1）、保持樣品的完整性。（2）、采集多重（波長）熒光分解及合成（overlay）圖像。（3）、所采集的熒光圖像比普通熒光顯微鏡質量好，更利于形態學觀察。（4）、可以只選擇出樣品中感興趣的區域（regionsofinterest，ROI）和深度進行掃描。（5）、獲取三維重建圖像2、獲取透射光及反射光圖像有、無熒光的樣品均可以用LSCM采集到其透射光圖像。當前第61頁\共有79頁\編于星期三\6點（二）熒光分子的定性及定位1、定性鑒定待測熒光物質2、熒光信號的定位（1）、單熒光定位（2）、多重熒光標記共定位（3）、熒光與透射光共定位當前第62頁\共有79頁\編于星期三\6點Confocalmicrographofmilkshowingmilkprotein(green),fat(blue),sugarcrystals(black)andcocoasolids(red).Bar=25mm當前第63頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第64頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第65頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第66頁\共有79頁\編于星期三\6點（三）定量測定LSCM將所采集的共聚焦圖像中的相關信息轉化為定量數據，即稱之為定量測定。（1）圖像中的任意區域（或線）的熒光強度。（2）熒光強度隨著時間、空間和波長的變化曲線和數據。（1）圖像中的任意區域（或線）的熒光強度（3）圖像內的幾何參數，包括面積、厚度、空間距離、體積等。按照定量測定中是否含有時間控制程（t），將掃描模式分為動態檢測和靜態測量。當前第67頁\共有79頁\編于星期三\6點當前第68頁\共有79頁\編于星期三\6點ThefigureshowsCa2+responsetoNAADPuncaginginmatureAsterinapectiniferaoocytesmeasuredwithconfocalmicroscope.當前第69頁\共有79頁\編于星