引物設計以基因為例詳解演示文稿當前第1頁\共有24頁\編于星期三\23點優選引物設計以基因為例當前第2頁\共有24頁\編于星期三\23點引物的設計原則設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率PARTONE當前第3頁\共有24頁\編于星期三\23點12引物長度一般引物長度為18~30堿基。決定引物熔解溫度（Tm值）最重要的因素就是引物的長度。長度越長，Tm值越大。長度過長，退火溫度和延長溫度相差太小，不利于延伸反應。長度過短，特異性低GC含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴引物設計原則當前第4頁\共有24頁\編于星期三\23點3引物自身和引物之間引物自身不應形成二級結構（如發夾結構）引物設計原則引物之間不能形成二聚體（包括同種引物之間或上游引物與下游引物之間）且引物不能與DNA其他區域錯配當前第5頁\共有24頁\編于星期三\23點引物設計原則4引物末端引物3′端：由于延伸從3′端開始，因而不能進行任何修飾；同時不應選擇A，因為A-A、A-G錯配。3’端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發引物5′端：主要限定引物長度，對擴增特異性影響不大；可以修飾，如添加限制性內切酶位點，將PCR產物亞克隆當前第6頁\共有24頁\編于星期三\23點引物設計原則引物5′端修飾技術附加核酸序列用途

限制酶位點克隆（如定向克隆）噬菌體啟動子合成RNA探針、測序蛋白質結合序列產物純化、檢測核糖體結合序列高效表達加錯配堿基造成突變定點誘變5避開靶基因的二級結構區當前第7頁\共有24頁\編于星期三\23點PARTTWO獲取目的基因利用Genbank數據庫搜尋DNA、mRNA或者蛋白質序列來設計引物當前第8頁\共有24頁\編于星期三\23點獲取目的基因當前第9頁\共有24頁\編于星期三\23點當前第10頁\共有24頁\編于星期三\23點mRNA對應DNA序列蛋白質一級結構蛋白質編碼區當前第11頁\共有24頁\編于星期三\23點外顯子對應的DNA序列、基因、編號當前第12頁\共有24頁\編于星期三\23點單擊CDS后當前第13頁\共有24頁\編于星期三\23點PARTTHREE引物設計利用生物軟件和網頁進行引物的設計和評價當前第14頁\共有24頁\編于星期三\23點引物設計Primerpremier5最常用的引物設計軟件Oligo7常和PP5聯用評估引物NCBIPrimer-blast近幾年NCBI推出的網站當前第15頁\共有24頁\編于星期三\23點當前第16頁\共有24頁\編于星期三\23點此區域輸入待測DNA序列當前第17頁\共有24頁\編于星期三\23點當前第18頁\共有24頁\編于星期三\23點當前第19頁\共有24頁\編于星期三\23點當前第20頁\共有24頁\編于星期三\23點當前第21頁\共有24頁\編于星期三\23點上游引物下游引物引物設計結果（一例）引物與DNA結合情況當前第22頁\共有24頁\編于星期三\23點RT-PCR由于后面要應用于RT-PCR，復制的是cDNA，而cDNA中沒有內含子，所以在設計引物時應該用編碼區結果：當前第23頁\共有24頁\編于星期三\23點簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。簡并引物M--ACS--GCW--ATR--GAY--TCK--GTB--GTCD--GATH