基因轉化方法與轉基因

植株鑒定當前第1頁\共有55頁\編于星期三\2點目的(外源)基因的導入

(1)農桿菌介導的遺傳轉化(2)DNA理化轉移方法電融合法(電激法)

基因槍法微注射超聲波處理法(3)種質系統轉化法主要包括花粉管通道法、胚囊及子房注射法和生殖細胞浸泡法。當前第2頁\共有55頁\編于星期三\2點一、農桿菌介導的基因導入(植物細胞)TransferringgenesintoplantcellsbycointegrationusingT-DNA，Tiplasmids，andagrobacterium基因導入方法:當前第3頁\共有55頁\編于星期三\2點1農桿菌感受態細胞的制備（1）挑取農桿菌（EHA105）單菌落接種于2.0mlYEB培養液中，28℃培養過夜。（2）取400μl菌液置于50mlYEB液體培養基中，28℃，220rpm，培養5-6hr，培養置OD600達到0.3~0.5。（3）菌液倒入5.0ml的離心管中，4℃，4000~5000rpm離心3min。（4）菌體懸浮于2ml0.15MNaCl，10000rpm離心3min。（5）用1ml預冷的20mMCaCl2輕輕懸浮，置于4℃，24hr內現用。當前第4頁\共有55頁\編于星期三\2點2表達載體向農桿菌的轉化（1）取200μl農桿菌感受態細胞，加入10~20μl質粒DNA，冰浴30min。（2）液氮中速凍3~5min，37℃水浴5min。（3）加入1mlYEB培養液，28℃，150rpm，培養4hr。（4）10,000rpm離心30sec，去上清。（5）再加入200μlYEB培養液懸浮細胞，涂布于YEB平板（含適量抗生素），28℃培養2d。當前第5頁\共有55頁\編于星期三\2點3陽性克隆的鑒定挑取平板上長出的單菌落，接種于YEB液體培養液（含有100μg/mlKan和125μg/mlRif）中，28°C振蕩培養過夜；小量提取質粒DNA，以質粒DNA為模板進行PCR擴增鑒定。當前第6頁\共有55頁\編于星期三\2點4、遺傳轉化(葉盤法)（1）無菌苗的獲得（試驗材料）

當前第7頁\共有55頁\編于星期三\2點（2）預培養取預出真葉的無菌子葉，剪去葉尖及葉柄部，置于無抗生素的MS固體培養基上，28℃預培養2d。

當前第8頁\共有55頁\編于星期三\2點（3）用于轉化番茄的農桿菌菌液的準備挑取農桿菌單菌落接種于YEB液體培養基（100mg/LKan和25mg/LRif）中，28℃振蕩培養至OD600約0.6~0.8，5000rpm離心集菌5min，用MS重新懸浮菌體，并將菌液稀釋10倍。

當前第9頁\共有55頁\編于星期三\2點（4）侵染、共培養將經過預培養的葉片放置于稀釋10倍的菌液中，侵染5min，期間不斷搖動。取出外植體，用濾紙吸干多余菌液，置于無抗生素的培養基上共培養（28℃暗培養2d）。當前第10頁\共有55頁\編于星期三\2點（5）抗性芽篩選經共培養2d的葉片轉入含抗生素的培養基上，三周左右長出不定芽和愈傷組織，每2~3周繼代培養一次。

當前第11頁\共有55頁\編于星期三\2點

轉化1天轉化2周煙草抗性愈傷的篩選篩選培養基：MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+200mg/LKan+250mg/LCef當前第12頁\共有55頁\編于星期三\2點轉化6周轉化煙草抗性芽篩選篩選培養基：MS+3mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+200mg/LKan+250mg/LCef當前第13頁\共有55頁\編于星期三\2點（6）生根培養待抗性芽長到3cm，移入生根培養基，2~3周后可觀察到幼根長出。當前第14頁\共有55頁\編于星期三\2點轉化植株生根篩選生根培養基：MS基本培養基+200mg/LKan+250mg/LCef當前第15頁\共有55頁\編于星期三\2點（7）移栽將生根良好的植株從三角瓶中小心取出，避免損害根莖，用水沖去多余的瓊脂，移入用水浸透的滅菌土中（蛭石：營養土=1：3）。當前第16頁\共有55頁\編于星期三\2點激素適宜濃度的篩選葉盤法轉化番茄體系的優化當前第17頁\共有55頁\編于星期三\2點葉盤法轉化番茄體系的優化農桿菌適宜稀釋濃度的篩選

1、菌液原液：侵染后不久外植體失綠，變灰暗，并且逐漸萎蔫。2、稀釋10倍：外植體有較多的愈傷及不定芽的分化。3、稀釋20倍：外植體有愈傷及不定芽的分化，但不如10好。農桿菌適宜侵染時間的篩選

侵染時間分別為5min、10min和20min：隨著農桿菌侵染時間的延長，番茄子葉外植體受到的傷害也逐漸加大，以至不能正常分化出不定芽。根據結果認為5min是較適宜的侵染時間。當前第18頁\共有55頁\編于星期三\2點葉盤法轉化番茄體系的優化乙酰丁香酮對轉化率的影響

在侵染的菌液和篩選培養基中均加入了200μM的乙酰丁香酮，根據觀察結果，加入乙酰丁香酮的外植體與對照相比其分化情況沒有明顯差異，表明加入乙酰丁香酮與否不能有效提高番茄突變體Chloronerva的轉化率。

適宜Kan濃度的篩選

以Kan濃度(mg/L)50、75、100為篩選梯度Kan濃度為75和100mg/L的培養基上，多數外植體開始變白，而在Kan濃度為50mg/L的培養基上，大部分外植體還保持綠色，不定芽的分化較好。

當前第19頁\共有55頁\編于星期三\2點葉盤法轉化番茄體系的優化適合于番茄突變體Chloronerva的遺傳轉化體系

（1）預培養條件：培養基為MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，培養時間2d。（2）共培養條件：培養基為MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，28℃黑暗培養2d。（3）篩選培養條件：培養基MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L。（4）生根培養條件：生根培養基采用：1/2MS+Kan25mg/L+Cef250mg/L。當前第20頁\共有55頁\編于星期三\2點轉化番茄抗性芽篩選

當前第21頁\共有55頁\編于星期三\2點抗性芽由平皿轉入瓶中培養篩選培養基：MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L+Kan50mg/L+Cef250mg/L當前第22頁\共有55頁\編于星期三\2點AChloronervaB35S::MxNas1篩選植株生根培養生根培養基：1/2MS+Kan25mg/L+Cef250mg/LA突變體ChloronervaB轉化植株當前第23頁\共有55頁\編于星期三\2點轉化植株生根后轉入土培轉基因番茄互補突變體Chloronerva表型當前第24頁\共有55頁\編于星期三\2點轉化小金海棠

當前第25頁\共有55頁\編于星期三\2點

轉基因煙草表型分析當前第26頁\共有55頁\編于星期三\2點轉基因煙草表型分析當前第27頁\共有55頁\編于星期三\2點MxIRT1轉化擬南芥當前第28頁\共有55頁\編于星期三\2點基因導入方法:二、基因槍法(Biolistic-bombardment)(植物細胞)當前第29頁\共有55頁\編于星期三\2點基因槍（particlegun）又稱微彈轟擊法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。最早是由Cornell大學研制的火藥基因槍。1990年，美國杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統。基因槍的組成部分有：點火裝置、發射裝置、擋板、樣品室、真空系統組成。基因槍轉化的基本步驟如下：

DNA微彈的制備

DNA-微彈載體的制備

靶外植體準備

DNA微彈轟擊

轟擊后外植體的培養

當前第30頁\共有55頁\編于星期三\2點基因導入方法:三、電擊法(Genetransferbyelectroporation)當前第31頁\共有55頁\編于星期三\2點四、花粉管通道法花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道（又叫花粉管引導組織），經珠心通道，將外源DNA攜帶入胚囊，轉化受精卵或其前后的生殖細胞（精子、卵子），由于它們仍處于未形成細胞壁的類似“原生質體”狀態，并且正在進行活躍的DNA復制、分離和重組，所以很容易將外源DNA片段整合到受體基因組中，以達到遺傳轉化之目的。當前第32頁\共有55頁\編于星期三\2點該方法可用于任何開花植物，將供體總DNA的片斷，在受體自花授粉后一定時期涂抹于柱頭上，使能沿著花粉管通道進入胚囊，轉化受精卵或其前后的細胞。實際應用時一般切除柱頭進行涂抹，這樣可減少DNA進入胚囊的距離，提高轉化率，但會影響結實率。當前第33頁\共有55頁\編于星期三\2點轉基因植物的鑒定當前第34頁\共有55頁\編于星期三\2點轉基因植物的鑒定遺傳鑒定表達鑒定表型分析鑒定利用報告基因Northern雜交Western雜交

直接鑒定DNA分子是否整合到基因組上。1）擴增目的片段；2）雜交信號鑒定。（Southern雜交）當前第35頁\共有55頁\編于星期三\2點檢測拷貝數一、Southernblot檢測當前第36頁\共有55頁\編于星期三\2點Southernblot制作探針：----- 根據試劑盒的要求確定DNA用量，一般不超過100ng.------ 反應結束后對探針最好用層析柱進行純化當前第37頁\共有55頁\編于星期三\2點-----不同的植物用于Southern雜交的DNA量不同，一般每泳道的擬南芥DNA的用量為10-25ug.-----一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶量，DNA的濃度不要過高。注意不同的酶要求的反應溫度不一樣。-----酶切后取少量樣品檢測酶切是否完全，如果不完全，可加酶后繼續酶切。DNA酶切當前第38頁\共有55頁\編于星期三\2點根據酶切后的目的片斷大小，一般采用0.7或0.8%的agarose。但當酶切后目的片斷較小時，要適當提高膠的濃度。記住電泳時兩邊的泳道要加標準分子標記。電泳是電壓不要過高，一般為1v/cm。最好電泳完畢后進行染色。電泳完畢要用比例尺對膠進行照相。DNA凝膠電泳當前第39頁\共有55頁\編于星期三\2點對膠的后處理：如果片斷較大（〉15kb)，凝膠需在0.2MHCl中處理10分鐘用水漂洗凝膠，加入1.5MNaCl,0.5MNaOH,處理45分鐘，并輕輕搖動。用水漂洗凝膠，與1MTis-HCl,(pH7.4),1.5MNaCl,輕輕搖動，中和15分鐘，當前第40頁\共有55頁\編于星期三\2點一般用尼龍莫一般實驗室多采用毛細管法轉膜緩沖液一般為10X的SSC或SSPE,轉膜時間一般為48hr。用UV確認轉膜是否完全。固定：UV0.4MNaOH,80oC烘烤1.5-2小時轉膜當前第41頁\共有55頁\編于星期三\2點Upwardcapillarytransfer5-8cm400g當前第42頁\共有55頁\編于星期三\2點二、Northernblot從植物中提取RNA方法1.熱酚法試劑： 提取緩沖液： 100mMLiCl 1%SDS 100mMTris-HCl(p8.0) 10mMEDTA TE緩沖液飽和酚 氯仿

4MLiCl

乙醇

75%乙醇

300mM醋酸鈉（pH5.2)當前第43頁\共有55頁\編于星期三\2點0.05%DEPCH2O(1LH2O中加入0.5mlDEPC,搖動混合4小時以上，120oC,滅菌30分鐘）20XMOPS: 0.4MMOPS 0.1MCH3COONa 0.02MEDTA pH7.0---500ml20XMOPS中，加大約 5.5克KOH后，慢慢調至pH7.0. 120oC,滅菌45分鐘.37%甲醛甲酰胺（-20oC保存）30%過氧化氫試劑當前第44頁\共有55頁\編于星期三\2點10mg/mlEtBr10XDye: 50%Glycerol,1mMEDTA,0.4%溴酚蘭， 0.4%二甲苯青FF,用DEPC處理水調制20XSSPEor20XSSC,

當前第45頁\共有55頁\編于星期三\2點-----電泳槽用5%過氧化氫處理2個小時以上，DEPC處理水清洗2次。-----滅菌、RNA專用瓶中加入80mlDEPC處理水及1.2克瓊脂糖，微波爐加熱溶解，60oC水浴上放置15分鐘，加入5ml20xMOPS及15ml甲醛溶液，灌膠。與通風櫥中進行。變性凝膠制備當前第46頁\共有55頁\編于星期三\2點----RNA加樣緩沖液：

35ul37%甲醛

100ul甲酰胺

5ul20XMOPS 20ul10xDye合計 160ul----- 4ulR