（優選）基因工程第二章基因工程的工具酶當前第1頁\共有51頁\編于星期三\2點限制性內切酶作為細菌體內保護自身、避免被噬菌體入侵的作用機制。當前第2頁\共有51頁\編于星期三\2點一、限制性內切酶的命名和種類1.命名：生物的屬名的第一個字母和種名的第一、二個字母命名，菌株的代號的一個字母，和羅馬數字表示。當前第3頁\共有51頁\編于星期三\2點EcoRIEscherichia屬名Coli種類Ry13株系編號第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株名；用羅馬數字表示發現的先后次序。當前第4頁\共有51頁\編于星期三\2點2.限制性內切酶的種類：平端5′突出粘端3′突出粘端當前第5頁\共有51頁\編于星期三\2點識別序列：在雙鏈DNA分子能夠識別的特殊核苷酸序列;一般為4-8bp1）二重旋轉對稱識別序列（回文序列）當前第6頁\共有51頁\編于星期三\2點3.限制酶的特點

1).識別順序和酶切位點

①識別４-8個相連的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；

SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外側，產生５’-端突起２）富含ＧＣ當前第7頁\共有51頁\編于星期三\2點

３）對稱性—雙對稱

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切點大多數在識別順序之內，也有例外

５）限制酶切后產生兩個末端，末端結構是５’-Ｐ和３’-ＯＨ

2).

末端種類

１）３’-端突起，個數為２或４個核苷酸

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，個數為２或４個核苷酸

EcoRI

5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’當前第8頁\共有51頁\編于星期三\2點３）

平齊末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互補的粘性末端ａ）切點在識別順序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13

ｂ）能識別簡并順序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

當前第9頁\共有51頁\編于星期三\2點５）相容性末端如：BamHIGGATCCBglII

AGATCTMboI,Sau3AINGATCN

上述幾種限制酶產生的DNA片段仍可相連，由此形成的重組分子能被MboI和Sau3AI識別和酶切，但BamHI和BglII的識別機率只有1/16。

BamHI+MboIA/C/G/TGATCT/C/G/A

BamHI和BglII(AGATCT)兩種酶產生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識別和酶切。

BamHI+BglIIA/GGATCT/C

不同末端的連接特性:除第4種末端不能進行不同DNA分子或同種DNA分子不同切點產生的末端相連外，其余4種末端可以相互連接。當前第10頁\共有51頁\編于星期三\2點4.同尾酶(Isocaudamer)有些來源不同的限制酶，識別及切割序列各不相同，但卻能產生出相同的粘性末端。MunI：5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`EcoRI：5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`5`-CAATTG-3`3`-GTTAAC-5`5`-GAATTC-3`3`-CTTAAG-5`重新連接后的序列：5`-CAATTC-3`3`-GTTAAG-5`兩種同裂酶切割形成的DNA片段經連接后所形成的重組序列，能否被原來的限制酶所識別和切割？當前第11頁\共有51頁\編于星期三\2點5.異源同序酶（Isoschizomer，同裂酶）

1.定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶

2.特點：1）識別相同順序

2）切割位點的異同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

6.限制酶的星反應（Staractivity）

1.

特點:限制酶識別序列特異性降低

2.

發生星反應的限制酶和條件（見下頁）

3.

星反應的利用和避免當前第12頁\共有51頁\編于星期三\2點表1具有星反應的限制性內切酶與條件限制酶誘發星活性的條件a識別序列AvaI1,2,4BamHI1-5,8GGATCN,GPuATCCBstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6NAATTNHaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亞乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μg)；

5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亞砜(8%);8:無NaCl。

當前第13頁\共有51頁\編于星期三\2點3.限制性內切酶作為基因工程常用工具酶的機制：當前第14頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第15頁\共有51頁\編于星期三\2點3.定向克隆的機制：當前第16頁\共有51頁\編于星期三\2點4.利用噬菌體克隆大片段DNA的機制：當前第17頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第18頁\共有51頁\編于星期三\2點5.重組DNA片段的檢測：1）抗藥性篩選當前第19頁\共有51頁\編于星期三\2點2）顯色性篩選當前第20頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第21頁\共有51頁\編于星期三\2點1.底物DNA：DNA的純度、分子構型、識別序列的側面序列、位點的偏愛和DNA甲基化有關系。2.限制性內切酶的用量：酶的活性單位：（U/μl）3.反應體系：20μl

DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme：0.5μl

ddH2O：14.5μl二、限制性內切酶的反應體系當前第22頁\共有51頁\編于星期三\2點4.雙酶切法：DNA：3.0μl（1.0μg）

10XBuffer：2.0μl

Enzyme1：0.5μl

Enzyme2：0.5μl

ddH2O：14.0μl5.雙酶切注意事項：1）兩個酶通用緩沖液中的活力；2）用量的控制；當前第23頁\共有51頁\編于星期三\2點6.具體操作時應注意事項：①整個操作應在0℃進行，即在冰浴中進行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。②當切割大量DNA時，通常采用延長反應時間，減少酶的用量。③當DNA需2種或以上酶切時，應用通用緩沖液，若沒有通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產物，再進行下一個酶切反應。

當前第24頁\共有51頁\編于星期三\2點限制酶在各種緩沖液中的相對活性

當前第25頁\共有51頁\編于星期三\2點DoubleDigestion(雙酶切反應)時UniversalBuffer(通用緩沖液)的使用表

當前第26頁\共有51頁\編于星期三\2點7.對酶切結果進行分析

通過限制性酶切可以得到一定數量的DNA片斷，DNA帶負電荷，因此，當DNA分子被置于電場中時它們就會向陽極遷移。這樣就可以通過凝膠電泳對酶切DNA片段進行分離。當前第27頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第28頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第29頁\共有51頁\編于星期三\2點內切酶在DNA上的所有識別位點都被切開。

完全消化（CompleteDigestion）12341234當前第30頁\共有51頁\編于星期三\2點只有有限數量的酶切位點被切開。通過縮短保溫時間、降低反應溫度或減少酶的用量可達到局部消化的目的。

局部消化123414部分酶切（PartDigestion）當前第31頁\共有51頁\編于星期三\2點第二節DNA連接酶（DNALigase）

1967年，世界上數個實驗室幾乎同時發現該酶。2.1基本性質：能將兩段DNA拼接起來的酶，催化DNA相鄰的5‘磷酸基團和3’羥基末斷之間形成磷酸二酯鍵，封閉DNA單鏈缺口。當前第32頁\共有51頁\編于星期三\2點2.2T4DNA連接酶的作用機制：①ATP+DNAligase(E)→E-AMP+PPi。②E-AMP上的AMP轉移到DNA的5’磷酸根上，使其活化，釋放出酶。③活化的5’磷酸根與相鄰的3’羥基形成3’,5’-磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。

當前第33頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第34頁\共有51頁\編于星期三\2點

8.1.3兩種DNA連接酶比較

T4DNAligaseE.coliDNAligase來源T4

噬菌體大腸桿菌分子量68kD75kD輔助因子ATPNAD+底物1)雙鏈DNA分子的粘、平端1)同源互補粘端

2)RNA-DNA雜合體、RNA鏈缺口2)雙鏈分子中的單鏈缺口

3)雙鏈DNA分子中的單鏈缺口應用范圍廣泛.效率高窄當前第35頁\共有51頁\編于星期三\2點修復雙鏈DNA缺口處的磷酸二酯鍵當前第36頁\共有51頁\編于星期三\2點修復與RNA結合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵當前第37頁\共有51頁\編于星期三\2點連接多個平頭雙鏈DNA分子：當前第38頁\共有51頁\編于星期三\2點注意：DNA連接酶不能連接兩條單鏈的DNA分子或環化的單鏈DNA分子，被連接的必須是雙螺旋DNA分子的一部分。當前第39頁\共有51頁\編于星期三\2點2.3DNA片段之間的連接2.3.1具互補黏性末端片段之間的連接基本原理：用DNA連接酶連接具有互補粘性末端DNA片段。當前第40頁\共有51頁\編于星期三\2點2.4具平末端DNA片段之間的連接基本原理：直接用T4DNA連接酶連接.

當前第41頁\共有51頁\編于星期三\2點2.5DNA片段末端修飾后進行連接1)DNA末端同聚物加尾后進行連接基本原理：利用末端脫氧核苷酸轉移酶轉移核苷酸的特殊功能在DNA的末端加尾。當前第42頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第43頁\共有51頁\編于星期三\2點2)黏性末端修飾成互補粘端或平末端后進行連接基本原理：

采用兩種方法①修平：用核酸酶切除雙鏈DNA分子的突出核苷酸，修平后用T4連接酶作平末端連接。②補平：用Klenow酶將粘端補平，產生平末端或匹配粘端，再用T4連接酶進行連接。當前第44頁\共有51頁\編于星期三\2點當前第45頁\共有51頁\編于星期三\2點

HindIII↓

↓XbaI

5’----ACTAGA----3’

3’----TTCGA

T----5’ dATP dTTPKlenowdGTPdCTPKlenow5’----AAG

CTAGA----3’3’----TTCGA

TCT----5’

T4DNAligase