對(duì)核因子NFκB在免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡中作用認(rèn)識(shí)

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB最初在鼠成熟B細(xì)胞和粒細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)并命名為細(xì)胞核Kappa輕鏈基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子，但是接下來(lái)的研究不斷發(fā)現(xiàn)其存在于多種細(xì)胞中。即使是病毒，如巨細(xì)胞病CMV、乙肝病毒HBV、人類免疫缺陷病毒HIV-1和流感病毒等都能有效利用NF-κB強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄功能。對(duì)NF-κB研究的興趣主要集中在對(duì)生物醫(yī)學(xué)具有相當(dāng)重要性的基因轉(zhuǎn)錄控制的可誘導(dǎo)性和可調(diào)控性上。其中對(duì)NF-κB和I-κB在免疫調(diào)節(jié)和疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用尤為關(guān)注。

NF-κB家族、結(jié)構(gòu)及一般功能

NF-κB是由兩個(gè)單體組成二聚體轉(zhuǎn)錄因子家族的原型，其單體包含約300氨基酸的DNA結(jié)合Rel區(qū)和I-κB結(jié)合區(qū)。目前所知NF-κB/Rel家族成員包括RelA、RelB、c-Rel、v-Rel、p50、p52、Dorsal、Dif和Relish等。NF-κB的活化形式由p50亞單位和p65亞單位組成的異源二聚體，在多種轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在靜態(tài)細(xì)胞，p50/p65二聚體在血漿中與I-κBα、I-κBβ和I-κBγ結(jié)合以防止其進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合DNA。Rel家族參與腫瘤的發(fā)生已得證實(shí)，同時(shí)也是活化NF-κB成員之一，而且不同形式的Rel成員可能活化不同的靶基因。

NF-κB特異性識(shí)別DNA元件5’-GGGRNYYYCC-3’。?分辨率時(shí)p50/p65二聚體的晶體結(jié)構(gòu)包含有5個(gè)堿基對(duì)5’-GGGAC-3’p50亞位點(diǎn)和4個(gè)堿基對(duì)3’-TTCC-5’p65亞位點(diǎn)，每個(gè)亞單位包含有2個(gè)通過(guò)由10個(gè)氨基酸組成的連接子相互結(jié)合的免疫球蛋白樣區(qū)。p50通過(guò)精氨酸54、精氨酸56、酪氨酸57、谷氨酸60、組氨酸64和賴氨酸241結(jié)合于5’亞位點(diǎn)，p65則通過(guò)精氨酸33、精氨酸35、酪氨酸36、谷氨酸39和精氨酸187結(jié)合于3’亞位點(diǎn)，這說(shuō)明p50/p65二聚體具有不同的啟動(dòng)子。p50二聚體-DNA復(fù)合物由10個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成有利于蛋白-DNA識(shí)別。

對(duì)NF-κB基因的克隆將有利于對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的精確認(rèn)識(shí)。p50DNA結(jié)合亞單位的克隆顯示NF-κB/I-κB系統(tǒng)是是一個(gè)通過(guò)胞漿/胞核分配控制蛋白功能的獨(dú)特模式。就像糖皮質(zhì)激素受體活化方式一樣，NF-κB可以看成是胞內(nèi)第二信使而將信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核。有必要指出的是NF-κB基因的表達(dá)在mRNA水平受到腫瘤壞死因子TNF-α和佛波酯的調(diào)節(jié)。p65亞單位行使著抑制亞單位I-κBα和I-κBβ受體的功能，并顯示出kappaB特異性DNA結(jié)合活性。65KD的蛋白p65在凝膠中具有獨(dú)特的移動(dòng)性。同時(shí)I-κB主要通過(guò)與p65相互作用而達(dá)到對(duì)NF-κB的抑制。

NF-κB抑制家族I-κB和IKK

在靜止細(xì)胞胞漿中NF-κB與其抑制蛋白I-κBα、I-κBβ和I-κBγ結(jié)合形成復(fù)合物。其它I-κB樣蛋白包括Bcl-3、I-κB-ε、I-κB-δ、Cactus和Relish等[1].NF-κB的活化需要I-κB的磷酸化和蛋白酶的快速降解。許多外界刺激如細(xì)胞因子、蛋白激酶活化因子、病毒、氧化物、細(xì)菌組成物[2-4]。然而，復(fù)合物NF-κB/I-κB的形成在體內(nèi)外能夠被快速而有效地逆轉(zhuǎn)。

I-κB激酶IKK是I-κB離開(kāi)NF-κB并使之得以活化的必需前提，隨之降解抑制因子I-κB。NF-κB的活化需要I-κBα32位和36位絲氨酸的磷酸化。但是在完整細(xì)胞I-κBα的磷酸化并不足以激活NF-κB。

完整的IKK復(fù)合物包括2個(gè)催化亞單位IKKα、IKKβ和1個(gè)伴隨亞單位NEMO或IKKγ。IKKα和IKKβ屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，而NEMO雖包含有多個(gè)蛋白反應(yīng)基序但卻無(wú)明顯的催化區(qū)。TNF-α刺激顯示c-IAP-1對(duì)NEMO的調(diào)節(jié)在IKK復(fù)合物的活化上作用特殊。NEMO保守的鋅指結(jié)構(gòu)對(duì)于NEMO的泛素化和IKK的活化至關(guān)重要[5]，特別是位于鋅指417位的殘基半胱氨酸[6]。IKKβ和其它激酶對(duì)IKKγ/NEMO的磷酸化在調(diào)節(jié)IKK活性的過(guò)程中發(fā)揮著相當(dāng)作用，IKKγ/NEMO碳末端144-159、369和375位殘基是IKKβ發(fā)揮磷酸化作用的主要位點(diǎn)[7]。IKKγ/NEMO是免疫、炎癥和凋亡通路上的中心分子。與此相反地是IKKγC417R在人單核細(xì)胞的IKK活性和NF-κB的活化上起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，使細(xì)胞對(duì)TNF-α和LPS調(diào)節(jié)的凋亡增加[6]。位于IKKβ螺旋-環(huán)-螺旋HLH基序與碳末端之間的絲氨酸從的自身磷酸化使IKK活性下降。對(duì)于IKKα，其絲氨酸176是NF-κB誘導(dǎo)激酶NIK磷酸化的主要位點(diǎn)。同時(shí)NIK在胸腺微環(huán)境的中心耐受上起著重要作用[8]。

如前所述，盡管存在許多影響和不同的信號(hào)通路，但是I-κB復(fù)合物和IKK復(fù)合物的磷酸化是NF-κB在一系列刺激下轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的前提。

NF-κB與免疫和炎癥反應(yīng)

NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一在天然免疫和獲得性免疫以及炎癥反應(yīng)中起著相當(dāng)作用。

一系列基因敲除研究顯示，P50-/-小鼠NF-κB/Rel復(fù)合物在特異性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)當(dāng)中發(fā)揮著其特有的功能。RelA-/-顯示RelA在粒細(xì)胞的生成上具有負(fù)性調(diào)控作用。c-Rel-/-小鼠研究說(shuō)明NF-κB在細(xì)胞因子調(diào)節(jié)和適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答功能發(fā)揮中作用突出。RelB-/-/p105-/-雙敲除表現(xiàn)出因強(qiáng)有力的滲透表型而至的高死亡率。這說(shuō)明多個(gè)Rel基因的敲除，其對(duì)細(xì)胞發(fā)育所造成的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)單基因的敲除。同時(shí)NF-κB/Rel信號(hào)通路的活化是T細(xì)胞激活的重要組成之一。胸腺細(xì)胞絕大多數(shù)NF-κB/Rel蛋白復(fù)合物常常由于I-κB突變而至信號(hào)失活。

NF-κB參與炎癥反應(yīng)。在急慢性炎癥性疾病中，黏附分子從外周循環(huán)募集T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞到達(dá)炎癥部位。NF-κB增加多種細(xì)胞因子和炎癥相關(guān)性酶如可誘導(dǎo)一氧化氮合酶，基因的表達(dá)?？烧T導(dǎo)酶環(huán)氧化酶-2也受到NF-κB的調(diào)節(jié)。將人外周血單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肺組織暴露于促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α或氧化劑中時(shí)引起明顯地NF-κB活化。NF-κB/Rel家族一直公認(rèn)為是能夠通過(guò)共激活多個(gè)炎癥性基因來(lái)擴(kuò)大疾病特異性炎癥過(guò)程通用的永久機(jī)

制。

NF-κB/Relp50和p65亞單位在體內(nèi)對(duì)抑制膿毒血癥或感染性休克時(shí)的高死亡率起著重要作用[9]。另外在慢性酒精中毒的環(huán)境下由失血性休克誘導(dǎo)的肝損傷敏感性的增加至少部分的受到增強(qiáng)的NF-κB活性的調(diào)節(jié)[10]。在臨床實(shí)踐中系統(tǒng)性NF-κB抑制物的應(yīng)用可能會(huì)對(duì)休克相關(guān)疾病產(chǎn)生有益的結(jié)果[11]。RelB通過(guò)對(duì)活化的組織成纖維細(xì)胞趨化因子表達(dá)的控制來(lái)限制炎癥過(guò)程的進(jìn)展。p50-/-小鼠對(duì)Th2細(xì)胞因子IL-5和趨化因子的產(chǎn)生缺陷，而且巨噬細(xì)胞炎性蛋白MIP-1α的產(chǎn)生不足，這說(shuō)明NF-κB在過(guò)敏性氣道炎癥反應(yīng)的噬酸粒細(xì)胞誘導(dǎo)中作用不容忽視。在OVA敏感小鼠支氣管應(yīng)用NF-κB寡聚脫氧核苷可引起氣道免疫細(xì)胞有效的核轉(zhuǎn)染，這表明局部免疫細(xì)胞NF-κB的活化參與哮喘發(fā)生的起效期[11]。NF-κB1缺陷小鼠對(duì)少突絞質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎具有明顯地抵抗性，故說(shuō)明NF-κB在在體自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化與分化中起著相當(dāng)作用。c-Rel缺陷小鼠對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的抵抗和p50缺陷小鼠在誘導(dǎo)的急慢性關(guān)節(jié)炎模型中的難控性表明NF-κB/Rel在炎性關(guān)節(jié)炎發(fā)病當(dāng)中的明顯作用。

糖皮質(zhì)激素因具有抗炎和免疫抑制作用而在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中備受關(guān)注。然而，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子MIF通過(guò)拮抗糖皮質(zhì)激素來(lái)發(fā)揮促炎作用。有趣的是，糖皮質(zhì)激素通過(guò)上調(diào)I-κBα轉(zhuǎn)錄來(lái)增加胞漿I-κBα蛋白的量，從而達(dá)到對(duì)NF-κB的抑制。因此，NF-κB、MIF和糖皮質(zhì)激素三者之間相互作用關(guān)系部分表述如下：MIF對(duì)糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的抑制NF-κB的反向調(diào)控是經(jīng)由阻止糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胞漿I-κBα的增加來(lái)完成，從而引起NF-κB的入核轉(zhuǎn)錄。再者，MIF通過(guò)一相同于脂多糖LPS的胞內(nèi)通路來(lái)使I-κB降解。在糖皮質(zhì)激素缺乏時(shí)MIF對(duì)LPS誘導(dǎo)的I-κBα減少無(wú)效，相反在LPS缺乏時(shí)MIF抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的I-κBα的增加。

NF-κB與凋亡

NF-κB/Rel通過(guò)參與多個(gè)目的基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)和凋亡。

NF-κB二聚體能夠保護(hù)胚胎肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡。RelA可能以完全相反的方式控制著依賴于細(xì)胞型和凋亡刺激特性的凋亡的發(fā)生。c-Rel具有誘導(dǎo)凋亡的作用。與c-Rel不同的是其配對(duì)體v-Rel并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是也有研究發(fā)現(xiàn)溫度敏感性v-Rel突變體卻能夠引起雞脾細(xì)胞的凋亡。NF-κB通過(guò)表達(dá)抗凋亡蛋白c-IAP-1和c-IAP-2來(lái)發(fā)揮在人癌細(xì)胞存活當(dāng)中的抗凋亡特性。然而，NF-κB在α病毒誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞株中顯示出促凋亡作用。NF-κB抑制TNF調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡，其中包括對(duì)凋亡抑制因子Bcl-2家族蛋白A1、Bcl-XL和IEX-1L的調(diào)節(jié)。NF-κB異常表達(dá)跟肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，這主要是通過(guò)對(duì)抗凋亡基因Bcl-2的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

NF-κB轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)產(chǎn)生包含死亡效應(yīng)區(qū)的蛋白，從而通過(guò)抑制caspase-8活性達(dá)到對(duì)TNF調(diào)節(jié)的凋亡抑制。在正常細(xì)胞，NF-κB1調(diào)控G0期細(xì)胞的存活，然而有絲分裂的順利進(jìn)行需要有不同的Rel/NF-κB因子來(lái)參與對(duì)細(xì)胞分裂周期的進(jìn)行和凋亡的防止的調(diào)控。NF-κB可以防止免疫調(diào)節(jié)自然殺傷性T淋巴細(xì)胞的凋亡[12]。反應(yīng)蛋白FIP-3能夠活化細(xì)胞死亡通路，并且抑制NF-κB依賴性存活機(jī)制，但是腺病毒蛋白AdE3能夠部分地反轉(zhuǎn)FIP-3誘導(dǎo)的凋亡。細(xì)胞對(duì)殺傷性因素的抗性主要可能是由于凋亡誘導(dǎo)因素TNF、電離輻射和癌性化療復(fù)合物柔紅霉素對(duì)NF-κB的激活所致。

KutukO和BasagaH業(yè)已證實(shí)非甾體類抗炎藥能夠抑制TNF-α和IL-1誘導(dǎo)的NF-κB活化和致敏Hela細(xì)胞的凋亡[13]。病毒如HIV、HBV、EBV、腺病毒、鼻病毒和流感病毒等利用NF-κB通路進(jìn)行自身復(fù)制、存活和對(duì)免疫應(yīng)答的逃避。另外許多病毒一方面利用NF-κB的抗凋亡特性來(lái)逃避宿主的防御機(jī)制，另一方面誘發(fā)凋亡達(dá)到病毒擴(kuò)散。流感病毒相關(guān)性腦病的外周血單核細(xì)胞能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子，并且其外周血單核細(xì)胞的活化與NF-κB激活有關(guān)[14]。在凋亡刺激存在時(shí)應(yīng)用NF-κB/Rel抑制治療可能會(huì)降低對(duì)腫瘤的抗凋亡界限，從而對(duì)腫瘤治療產(chǎn)生一個(gè)更加有效的效果。也有研究表明抑制NF-κB跟癌性化療呈現(xiàn)平行關(guān)系。因此，NF-κB/Rel在不同的條件和不同的刺激下顯示出促凋亡和抗凋亡的雙重特性。這為凋亡相關(guān)性疾病的治療提供了有力的線索。

自達(dá)1995年發(fā)現(xiàn)p65/RelA亞單位敲除小鼠因肝功能退化而在發(fā)育第16天死亡起，人們不斷將注意力集中到NF-κB在不同疾病中的重要作用以及與之相關(guān)的治療策略上。NF-κB已被列為一靶目標(biāo)來(lái)作為疾病治療的輔助性方式之一。

通過(guò)對(duì)NF-κB與疾病關(guān)系的研究，以用來(lái)對(duì)諸如自身免疫性疾病、病毒相關(guān)性疾病、腫瘤、炎癥、休克和哮喘等多種疾病的治療發(fā)現(xiàn)新策略。特異性NF-κB/Rel抑制物的開(kāi)發(fā)將會(huì)降低像非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素等治療的副作用以及為一系列疾病的治療提供可能。對(duì)p50的局部抑制可能防止導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞的炎癥和滑液組織反應(yīng)。阻斷NF-κB活性可能是一個(gè)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效措