基因功能分析的基本策略第一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第十二章基因功能分析的基本策略第二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五轉基因模型是研究基因功能的主要手段轉基因生物：外源基因導入生物體表達?；虼虬校和庠椿蛱鎿Q內源基因?；蚯贸??；蚯萌??；虺聊簩胩囟ɑ?，抑制內源性基因表達。第三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第一節轉基因技術轉基因技術(transgenictechnology)：將外源基因導入細胞，隨機整合到受體基因組內，并隨細胞分裂而遺傳給后代。細胞模型。轉基因動物。轉基因植物。第四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五一.轉基因生物的意義20世紀80年代(BrinsterandPalmiter)：著名的轉基因小鼠實驗，金屬硫蛋白基因啟動子驅動大鼠生長激素基因表達。轉基因生物的用途：研究手段：疾病的轉基因動物模型。改良動物性狀：抗病性、耐寒性等。生產產品：抗體、疫苗等的生產。第五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五二、基本原理構建攜帶目的基因的載體。外源基因導入：將目的基因通過顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵或著床前的胚胎細胞中。使目的基因整合到基因組中。將此受精卵或著床前的胚胎細胞再植入受體動物的輸卵管或子宮中。使其發育成攜帶外源基因的轉基因動物。第七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基本原理供體基因受體的受精卵第八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基本原理轉基因的受精卵第九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基本原理轉基因動物第十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基本過程上游—基因改造和載體構建中游—基因轉移、胚胎移植與建系下游—基因整合、表達的檢測與細胞篩選第十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五1.上游—基因改造和載體構建外源基因:完整的轉錄單位,由順式作用元件、結構基因和轉錄終止信號組成。報告基因(reportergene):在表達載體中引入易于檢測的提示重組體存在的基因。GFP、LacZ、AP、LUC。融合基因(fusiongene):將特定的目的基因與報告基因拼接成融合基因，并與順式作用元件拼接成完整的轉錄單位。第十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五動物轉基因常用的載體腺病毒載體逆轉錄病毒載體非病毒類載體：如質粒等。第十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五2.中游—基因轉移、胚胎移植與建系基因導入技術：物理、化學和生物學方法

1)顯微注射法（microinjection)2)胚胎干細胞法（embryonicstemcells,ES細胞）

3)逆轉錄病毒感染法

4)精子載體法第十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五1)DNA顯微注射法制備超量受精卵。DNA顯微注射。轉移注射卵到輸卵管或子宮。轉基因鼠的鑒定及鼠系建立。第十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五DNA顯微注射持卵管DNA注射針精原核卵原核第十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五DNA顯微注射DNA顯微注射到尚未發生核融合的受精卵的精原核。顯微鏡下觀察，精原核比卵原核大，容易辨別。線性DNA整合效率比超螺旋DNA高出數倍，因而用于顯微注射的轉入基因通常是去除載體序列的線狀DNA。第十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五DNA顯微注射法的特點DNA大小無限制，最大可達250Kb。隨機整合：在染色體上整合的位點是隨機的，整合的拷貝數也不一定。轉入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干擾該基因的正常表達，影響轉基因動物的正常發育和代謝?？傂瘦^低(實際成功率1/1000)。第十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五提高顯微注射DNA表達的成功率轉入的外源基因要能夠高效表達，最好是可以誘導表達。轉入基因中應該包含有幫助提高整合效率的序列，如微衛星序列。微衛星序列微衛星序列誘導表達啟動子外源基因第二十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第二十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五2)胚胎干細胞法胚胎干細胞(embryostemcells,ES細胞)：可人工培養增殖的小鼠胚泡發育期胚胎細胞，當把這種胚胎細胞重新導入另一胚泡期的胚胎之后，它仍然保持著分化成其他類型細胞的能力。ES細胞具有與胚胎細胞相似的形態特征和分化特性。第二十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五胚胎干細胞法分離和培養ES細胞。外源基因導入ES細胞。導入外源基因的ES細胞的子宮轉移。轉基因鼠的鑒定及鼠系建立。第二十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五胚胎干細胞的分離和培養胚泡培養皿中分離胚泡內層細胞胰蛋白酶消化解離加飼養層細胞培養胚胎干細胞第二十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五胚胎干細胞的分離和培養第二十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五胚胎干細胞外源DNA的導入DNA胚胎干細胞囊胚原囊胚轉基因動物磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法微注射第二十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五外源DNA的整合用于ES細胞的DNA載體一般帶有定點整合元件,避免了隨機整合。定點整合位點應選擇在基因組內編碼非必需產物的地方，以減少整合對細胞正常功能的影響。定點整合位點必須在基因組的可以進行轉錄的地方。第二十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五胚胎干細胞法的特點定點整合。ES細胞在體外培養，外源DNA導入后可用正-負選擇法篩選擇正確整合的ES細胞,相對較簡單。目前只在小鼠身上獲得成功。第二十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第二十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五3）逆轉錄病毒感染法逆轉錄病毒載體的構建獲得四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚外源DNA導入早期胚胎：獲得病毒顆粒感染早期胚胎包裝細胞與早期胚胎共培養感染后的胚胎植入受體動物子宮，發育成攜帶外源基因的動物。第三十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五逆轉錄病毒感染法外源基因逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒感染四/八細胞胚胎/囊胚/原腸胚嵌合小鼠純合體小鼠第三十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五逆轉錄病毒感染法的特點通過病毒DNA插入宿主DNA的機制，將外源目的基因整合到宿主基因組，整合效率高。反轉錄病毒載體容量有限，只能轉移小片段DNA(＜10kb)。對家禽類的轉基因研究有重要意義。第三十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五4）精子載體法外源DNA精子卵細胞受精卵轉基因動物共育法脂質體轉染法電穿孔法第三十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五DNA精子受精卵DNA卵細胞DNA胚胎干細胞DNA逆轉錄病毒感染磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法四細胞胚胎囊胚原腸胚轉基因動物微注射顯微注射第三十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五3.下游—基因整合與表達檢測及篩選染色體基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數。轉錄水平：轉基因的mRNA的存在與否以及表達水平。蛋白水平：轉基因的蛋白質的表達以及功能檢測。第三十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五鑒定方法PCRSouthernblot染色體原位雜交NorthernblotRT-PCRWesternblot第三十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基因轉移鼠純合鼠系的建立×轉基因雜合鼠未轉基因鼠生殖系細胞中不含轉入基因生殖系細胞中含轉入基因子代多次交配可得到純合轉基因鼠系第三十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五三、轉基因動物的應用分析動物表型與外源基因的關系，揭示外源基因的功能。建立人類疾病的轉基因動物模型。基因產品的制備：乳腺、膀胱生物反應器。第三十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五人類疾病的轉基因動物模型完整的動物模型可以模擬人類疾病的起始和發展，幫助了解疾病的病因和發展過程。為測試各種可能的治療方案提供一個統一有效的系統。轉基因動物模型提供了人類疾病的研究手段。第三十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五人類疾病的轉基因動物模型各種人類遺傳病的鼠模型，如：老年性癡呆癥(Alzheimer’sdisease)、關節炎(arthritis)、肌肉營養缺乏癥(musculardistrophy)、腫瘤發生(tumorigenesis)、高血壓(hypertension)、神經退行性疾病(neurodegenenerativedisorder)、內分泌功能障礙(endocrinological

disfunction)、動脈硬化癥及其他很多疾病。第四十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五利用轉基因動物反應器生產藥用蛋白轉基因動物反應器：乳腺、膀胱、血液生物反應器等?？鼓窱II：轉基因綿羊的乳汁中。β乳球蛋白紅細胞生成素凝血因子VIII凝血因子IX生長激素第四十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五轉基因改良移植器官改造異種來源器官的遺傳性狀，使之適應于人體器官或組織的移植。1997年起，利用遺傳改良的轉基因豬肝做為嚴重肝病患者的離體生命支持物。第四十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五動物的克隆1996年，首次實現動物的無性生殖。由綿羊的乳腺細胞提供細胞核，卵細胞提供細胞質發育而來。核移植技術（NuclearTransfer)第四十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五核移植技術（NuclearTransfer)第四十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第四十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第二節基因打靶基因打靶(GeneTargeting)

：通過DNA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內研究此基因的功能?；蚯贸?geneknockout):將某個基因定向去除。基因敲入(geneknockin):定向將一段基因序列替代另一段基因序列。第四十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五一、基因打靶的基本程序打靶載體的構建。打靶載體導入ES細胞及其鑒定?；蚯贸鼸S細胞注射入胚泡。胚泡植入假孕小鼠的子宮。嵌合體的雜交建立基因打靶的純合鼠系。第四十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五1.打靶載體的構建同源基因片段質粒載體HB1HB2neor基因HSV-tk基因第四十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五2.打靶載體導入ES細胞磷酸鈣-DNA共沉淀法逆轉錄病毒感染法電穿孔法脂質體轉染法顯微注射法第四十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五打靶載體的正-負選擇與整合位點兩端區域同源的兩段DNA序列(HB1和HB2)。目的基因。編碼抗G418的新霉素磷酸轉移酶基因（neor基因）。2個不同的胸苷激酶基因（HSV-tk1和HSV-tk2），分別來自I型II型單純皰疹病毒。第五十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五打靶載體的正篩選

tk1HB1neorHB2tk2載體載體同源重組neorG418正篩選，細胞存活染色體染色體第五十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五打靶載體的負篩選

tk1HB1neorHB2tk2染色體染色體非特異性整合

GCV負篩選，細胞死亡第五十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五PCR鑒定在打靶載體的HB1和HB2之間，加上一個載體和鼠的基因組中都沒有的獨特DNA序列（US）。如發生隨機整合，PCR無法擴增出預期的DNA片段。如果整合于特定位點時，則PCR可以擴增出預期大小的片段。第五十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五PCR鑒定：特異整合tk1HB1USneorHB2tk2P2P1PCR反應有特異條帶特異整合第五十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基因敲除小鼠的獲得基因敲除ES細胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮嵌合體的雜交育種：同源重組只發生在一條染色體上，因而同源重組后只能得到嵌合體，將嵌合體雜交，即可得到純合子。×第五十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第五十六頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基因敲除和RNA干擾基因敲除是在基因水平將某個基因定點去除，動物整體水平。RNA干擾不是敲除基因，而是誘導RNA的特異性降解，干擾基因的表達。一般是在細胞水平。第五十七頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五第三節RNA干擾1990年，Jorgense等通過轉基因改造牽?；伾?。外源基因不但不能加深花的顏色，反而造成內源基因表達的降低。

第五十八頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五RNA干擾是dsRNA導致的基因沉默1998年，Fire等在

C.elegans中用antisenseRNA抑制基因表達。dsRNA

比sense或antisenseRNA都好。注射甚至口服

dsRNA都能誘發基因沉默。很少量的雙鏈

RNA就能誘發C.elegans整體的基因沉默，甚至能傳遞到子一代。RNA干擾：RNAinterference(RNAi)

第五十九頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五RNAi是真核生物中廣泛存在的現象

植物：干擾因素自葉脈向外擴散，綠色熒光蛋白(GFP)基因被抑制，顯露出紅色。

線蟲：左側為

GFP轉基因線蟲；右側線蟲則經

GFPdsRNA處理。部分細胞

RNAi相關蛋白表達較低，仍有綠色熒光。

Hela細胞：經ORC6siRNA作用后，細胞出現多核現象。綠色為tubulin，紅色為DNA。ORC6細胞分裂調控蛋白。

果蠅：右側果蠅為野生型，左側為

shRNA

造成的色素缺乏的缺陷型。第六十頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五RNA干擾RNA干擾：雙鏈RNA誘導的同源mRNA降解。RNA干擾技術可以用于基因敲除，選擇性關閉特定細胞基因。第六十一頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五siRNA的產生Dicer：RNaseIII的一種，可降解dsRNA成siRNA。ShortinterferingRNA(siRNA)：21~23nt第六十二頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五siRNA誘導同源序列的降解RNA-InducedSilencingComplex產生兩種后果：同源mRNA的降解。同源mRNA翻譯受阻。第六十三頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五基因沉默的機制是多方面的dsRNA造成的mRNA降解。Post-translationalgenesilencingdsRNA造成同源性基因的甲基化和表達關閉。dsRNA造成染色質結構變化。dsRNA對蛋白質的合成產生影響。第六十四頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五RNAi和基因敲除在基因組DNA上，通過同源重組進行的基因敲除。在mRNA水平進行的基因敲除：AntisenseoligonucleotidesRibozymeRNAinterference：dsRNA；siRNA；shRNA第六十五頁，共七十二頁，編輯于2023年，星期五dsRNA能夠誘發細胞的抗病毒反應在哺乳動物存在干擾素相關的抗病毒體系。dsRNA激活dsRNA-dependentproteinkinase(PKR)，進一步誘導非序列依賴的內源性RNA降解。在胚胎期細胞，上述非特異