發酵工業菌種第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五本章內容

一、常用的工業微生物二、發酵工業菌種篩選的原則與基本技術三、發酵工業菌種改良第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五對產物進行菌種篩選時，有兩條經驗：進化上向上兼容；次生代謝在進化上后移，芽孢菌以上才有篩選意義。一、常用的工業微生物第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五細菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌一、常用的工業微生物第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

未培養微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養分離及培養方法還未獲得純培養的微生物，其在自然環境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法模擬自然培養法:

原位培養、培養條件優化、單細胞操作宏基因組分析法第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五二、發酵工業菌種分離篩選原則與基本技術（一）發酵工業菌種篩選的總趨勢與要求（二）分離篩選原理與技術（三）應用舉例第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五1.菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發基因突變→基因重組的定向育種

（一）發酵工業菌種篩選的總趨勢與要求第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

2.菌種選擇的要求

能在廉價原料制成的培養基上迅速生長，且生成的目的產物產量高、易于回收；

生長速度和反應速度較快，發酵周期較短；培養條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強；第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五2.菌種選擇的要求（續）菌種不易變異退化；對放大設備的適應性強；菌種不是病原菌，不產生任何有害的生物活性物質和毒素。第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五（二）分離篩選原理與技術1.篩選的指導思想2.分離篩選工作在實際中應用的幾個方面3.

新種分離篩選原理與技術第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五1.篩選的兩種指導思想

先分離純化，再結合工藝要求進行篩選。分離純化同時富于篩選條件，一步得出所需菌株。結果有兩種可能：獲得適于工業發酵菌株只獲得選育所需的出發菌株

第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五2.分離篩選工作在實際中應用的幾個方面從被污染的生產及科研用菌中分離目的菌；

生產中長期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業目的的優良菌株；從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發酵產品的產生菌；尋找老產品的新的優良菌株。從保藏機構獲取菌種進行分離篩選有兩個好處：經濟性指導性第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五設計篩選方案時必須考慮兩個要點

選擇性靈敏度

第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五3.新種分離與篩選的步驟

調查研究（包括資料查閱）

試驗方案設計

含微生物樣品的采集（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預處理（如何在后續的操作中使這種可能性實現）

菌種分離

第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

根據目的菌株及其產物特點分

選擇性分離方法 隨機分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統進行間接分離）

富集液體培養固體培養基條件培養

(初篩)

菌種純化

復篩

菌種分離第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

菌種純化初步工藝條件摸索再復篩生產性能測試較優菌株1-3株保藏及進一步做生產試驗某些必要試驗和或作為育種的出發菌株毒性試驗等

第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五含微生物樣品的采集采樣時應注意的問題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節土壤的酸堿度對于分離篩選新菌種，還存在另兩個選擇標準：土壤來源廣泛在已適應相當苛刻環境壓力的微生物類群中尋找新菌種第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五樣品的預處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學方法誘餌法第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五分離方法的選擇

根據目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養特征獨特

生長特征獨特

無選擇性特征根據產物的特征進行隨機分離選擇性分離的關鍵：生長培養條件的選擇與控制，從而實現定向富集篩選。選擇性分離

第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

選擇性分離原理和技術生長條件的選擇與控制原理控制營養成分

控制培養基酸堿度

添加抑制劑

控制培養溫度

控制通氣條件

選擇性分離技術富集液體培養技術固體培養技術施加選擇壓力，進行定向篩選

第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五A.富集液體培養增加混合菌群中所需菌株數量的一種技術技術特點：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養方式分批培養方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時間和次數等問題連續培養方式：以比生長速率（μ）篩選第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

μ

ABS0基質濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當S<S0時，富集什么菌株？當S>S0時，富集什么菌株？第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五連續富集培養技術分離菌株的優點

分離的菌株特別適合連續發酵生產過程有利于分離具有某種工業生產特性的菌株可以篩選出能共生的穩定混合培養物

第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五B.固體培養技術常用于分離某些酶產生菌

選擇壓力：在選擇培養基中加入所需酶的基質

第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五隨機分離原理與技術從產物入手，通過設計高產培養基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術關鍵：產物合成條件的選擇與控制及相應篩選方法的確定。隨機分離技術舉例

抗生素產生菌的篩選藥理活性化合物產生菌的篩選生長因子產生菌的篩選多糖產生菌的篩選

第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五高產培養基設計的幾個原則

制備一系列的培養基，其中有各種類型的養分成為生長限制因素；使用一聚合或復合形式的生長限制養分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進劑及抑制劑的采用。第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五抗生素產生菌的篩選篩選模型：試驗菌篩選方法：鋪菌法復印平板法液體培養篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內酰胺酶產生菌（克雷白氏菌）協同

I II無試樣時（不含棒酸時），I對II菌作用不大有試樣時（含棒酸時），I對II菌恢復藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養篩選第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五試驗菌代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p革蘭氏陽性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽性桿菌 大腸桿菌革蘭氏陰性腸道細菌恥垢分枝桿菌607

結核桿菌 白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌

絲狀真菌

第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五藥理活性化合物產生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個關鍵酶的微生物產物即酶抑制劑，從而達到治療的目的。篩選模型：目標酶第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五生長因子產生菌的篩選

篩選模型：營養缺陷型試驗菌

篩選方法：利用被分離的微生物產物能否促進營養缺陷型試驗菌生長第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五氨基酸產生菌的篩選

樣品

預處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復印平板（copy法）

平板培養，其中有產生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應到copy前相應

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養缺陷型試驗菌的瓊脂

培養后

產氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養，對產物進行定量測定篩選產物含量高的菌株第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五多糖產生菌的篩選取樣特點：碳水化合物工業的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據液體培養測定多糖含量來篩選高產菌。第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五細菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養24-48h培養基中長出絹絲狀波動物，鏡檢桿狀，陽性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養基分批富集培養2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養基

根據透明圈挑選菌落

性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機酸呈黃斑點）

乳酸生成量測定（滴定法）第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五放線菌的分離：

以產鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業發酵液（含孢子）樣品1環放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產菌恢復根據高產菌的特點，選擇目的菌落放大培養，發酵液性能測試篩選模型：形態依據第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五真菌的分離篩選：以啤酒酵母為例

取發酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養基上，25℃培養48-72h

形態篩選根據正常株特點進行挑選，接種斜面備用

純化，采用平板分離法進一步純化，至少反復三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發酵力測定性能測定③熱死溫度測定 ④凝集力測定 ⑤雙乙酰含量測定第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五菌種選育改良的具體目標提高目標產物的產量提高目標產物的純度，減少副產物改良菌種性狀，改善發酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產的新產品第三十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

發酵工業菌種改良方法常規育種(誘變育種)細胞工程育種基于代謝調節的育種技術基因工程育種蛋白質工程育種代謝工程育種

第四十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五賴氨酸生產菌種的選育改良思路出發菌株：黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發酵短桿菌育種思路

1.優先合成的轉換——滲漏缺陷型的選育

2.切斷支路代謝——營養缺陷型的選育：高絲氨酸缺陷型

3.抗結構類似物突變株的選育

4.解除代謝互鎖：Leu-、

抗Leu結構類似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前體物的合成和阻塞副產物的生成

6.改善細胞膜的透過機能

7.選育溫度敏感突變株

8.應用細胞工程和基因工程育種第四十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五第四十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五選育適宜的CO2固定酶/TCA循環酶活性比突變株賴氨酸合成中間代謝有以下兩條途徑：①通過TCA循環葡萄糖丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸

賴氨酸②通過磷酸烯醇丙酮酸羧化反應葡萄糖磷酸烯醇草酰乙酸天冬氨酸式丙酮酸丙酮酸賴氨酸第四十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期五

代謝工程的定義利用多基因重組技術有目的地對細胞代謝途徑進行修飾、改造，改變細胞特性，并與細胞基因調控、代謝調控及生化工程相結合，為實現構建新的代謝途徑，生產特定目的產物而發展起來的一個新的學科領域。又稱作途徑工程，是