抗氧化活性研究方法演示文稿目前一頁\總數(shù)十六頁\編于十四點優(yōu)選抗氧化活性研究方法目前二頁\總數(shù)十六頁\編于十四點目錄一.檢測抗氧化活性的原因二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性三.檢測方法四.DPPH法（原理，一般方法，酶標法）五.ABTS法六.TBARS法七.鐵離子還原能力(FRAP)目前三頁\總數(shù)十六頁\編于十四點一.檢測抗氧化活性的原因

1.天然植物中許多化學物質具有抗氧化活性2.抗氧化劑有延緩衰老等功效，越來越受到人們關注3.據(jù)文獻記齊墩果酸型三萜有較好的抗氧化活性4.抗氧化活性測試簡單，快捷，經(jīng)濟目前四頁\總數(shù)十六頁\編于十四點

二.自由基的產(chǎn)生及抗氧化的重要性抗氧化劑自由基對人體造成的傷害天然植物目前五頁\總數(shù)十六頁\編于十四點三.檢測方法目前常用的抗氧化活性檢測方法主要基于以下機理：(1)在特定條件下，樣品對檢測體系中脂類物質的氧化抑制能力反映被測物的抗氧化活性；（TBARS法）(2)在特定條件下，樣品對檢測體系中自由基的清除能力反映被測物的抗氧化活性；（DPPH自由基的清除）(3)在特定條件下，測定樣品的還原能力反映被測物的抗氧化活性。（還原Fe3+）

目前六頁\總數(shù)十六頁\編于十四點四.DPPH法1.原理

DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基。

特點：醇溶液呈紫色，波長為517nm下具有最大吸收。具有單一電子，故能接受一個電子或氫離子，有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降,吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，從而以評價試驗樣品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化性越強。目前七頁\總數(shù)十六頁\編于十四點實驗步驟

2.實驗步驟

（1）酶標法檢測——酶標儀取96孔細胞培養(yǎng)板，各孔分別加入150μmol·L-1的DPPH溶液180μL,各濃度梯度樣品溶液20μL,終濃度分別為3.9~500μmol·L-1，反應總體積200μL,以溶劑作對照。加樣后，振蕩混勻。封板膠封板后，室溫下避光靜置。分別在10~120min時間范圍內(nèi)于517nm處測定各孔吸光度值。觀察樣品抗DPPH的時效量效變化過程，確定實驗的穩(wěn)定性和最佳實驗反應時間。計算公式為:清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）x100％目前八頁\總數(shù)十六頁\編于十四點VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲線10-120min內(nèi),隨著作用時間的延長VitE抗DPPH作用增強，但在3.9-31.2μmol·L-1范圍內(nèi)，各時間點的藥效變化不明顯，62.5-500μmol·L-1濃度范圍，隨著濃度增加，各時間點的藥物作用曲線逐漸分離，并在500μmol·L-1，各時間點量效趨于平穩(wěn)。從圖中可以看出，在這些時間點中，30min的量效曲線基本呈斜線上升。30min目前九頁\總數(shù)十六頁\編于十四點VitE清除DPPH自由基抗氧化量效曲線

反應時間t為30min的量效曲線（相關系數(shù)）目前十頁\總數(shù)十六頁\編于十四點實驗步驟（2）一般方法——紫外分光光度計法將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL樣品加入3.5mLDPPH甲醇溶液(0.06mmol/L)，混合30min后測定515nm處吸光度。每份樣品平行操作3次。

計算公式為:清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）x100％目前十一頁\總數(shù)十六頁\編于十四點酶標法優(yōu)勢3.酶標法優(yōu)勢

抗氧化微孔板實驗方法的優(yōu)勢：①耗材量少，試劑量以微升計；②試劑種類少，部分試劑配制可交互使用；③方法簡便，耗時短；④可重復性強，可以廣泛應用于藥物篩選，特別是高通量藥物篩選研究。目前十二頁\總數(shù)十六頁\編于十四點五.ABTS法

1.原理以水溶性的ABTS+自由基引發(fā)劑為顯色劑。

特點：ABTS與過硫酸鉀反應生成穩(wěn)定的藍/綠色陽離子自由基ABTS+，最大吸光波長為734nm。

向ABTS+其中加入被測物質，如果該物質中存在抗氧化成分，則該物質會與ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色，然后在ABTS+這種自由基的734nm吸光波長下檢測吸光度的變化來反映物質的抗氧化能力。目前十三頁\總數(shù)十六頁\編于十四點實驗步驟

2.實驗步驟將樣品用甲醇配制成一系列濃度,取0.15mL樣品加入2.85mLABTS自由基工作液，混合，放置10min后,在734nm處測定吸光度。每份樣品平行操作3次。計算公式為：清除率(％)=[A(溶劑)-A(樣品)]/A（溶劑）×100％A（溶劑）為2.85mLABTS溶液與0.15mL甲醇混合后的吸度，A（樣品）為2.85mLABTS溶液與0.15mL樣品混合后的吸光度。

目前十四頁\總數(shù)十六頁\編于十四點ABTS法優(yōu)缺點3.優(yōu)缺點

簡便，快速，適合于大量樣品的檢測。

ABTS在與氫原子供體的反應中選擇性差是此法的一個不足，它可與任何羥基化的芳香族化合物反應，這與它們的實際抗氧化能力關，因此,TEAC值也包括對抗氧化不起作用的羥基。目前十五頁\總數(shù)十六頁\編于十四點六.TBARS法簡介脂質體系中氧化反應抑制或中止的判斷主要通過測量被氧化物的濃度，氧的去除或氧化產(chǎn)物的形成。