基因編輯技術的概念和原理目前一頁\總數四十一頁\編于十三點什么是基因編輯技術？基因編輯是指對基因組進行定點修飾的一項新技術。利用該技術，可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上剪斷靶標DNA片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變，又修改并編輯了原有的基因組，真正達成了“編輯基因”。目前二頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯的研究背景傳統的動物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費大量的人力、物力和財力，經歷漫長的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進展。

目前三頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯的研究背景現代動物分子育種中，分子標記技術能夠定位與經濟性狀相關的分子標記，鎖定基因與性狀的對應關系，從而快捷可靠地對動物后代進行篩選。但是，利用分子標記技術輔助篩選，改良的程度依然受限于品種自身已有的基因。所以，利用基因工程技術進行品種改良，可以突破種源的限制及種間雜交的瓶頸，獲取新品種，因此分子育種更為本質和直接。目前四頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯的研究背景目前，獲得突變體的常見方法是利用T-DNA或轉座子構建大規模的隨機插入突變體庫，但是構建覆蓋全基因組的飽和突變體庫需要的工作量大且耗費的時間長。而通過定點突變的方法使目的基因完全失活，是一種最直接有效的研究特定基因功能的方法。目前五頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯的研究背景近年來，隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現和技術體系的完善，基因組編輯技術獲得了飛速發展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點基因敲除、敲入變得更為簡單且高效。目前六頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯的優勢與傳統的以同源重組和胚胎干細胞(embryonicstemcell，ES)技術為基礎的基因打靶技術相比，基因編輯新技術保留了可定點修飾的特點，可應用到更多的物種上，效率更高，構建時間更短，成本更低。目前七頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯原理現代基因組編輯技術的基本原理是相同的，即借助特異性DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strandbreaksDSBs)激活細胞天然的修復機制，包括非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(HDR)兩條途徑。目前八頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯原理非同源末端連接（NHEJ）是一種低保真度的修復過程，斷裂的DNA修復重連的過程中會發生堿基隨機的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實現目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ機制會將其連入雙鏈斷裂DSB位點，從而實現定點的基因敲入。目前九頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯原理同源重組修復（HR）

是一種相對高保真度的修復過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點，不會出現隨機的堿基插入或丟失。如果在一個基因兩側同時產生DSB，在一個同源供體存在的情況下，可以進行原基因的替換。目前十頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯原理目前十一頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯技術的種類目前主要有3種基因編輯技術，分別為：人工核酸酶介導的鋅指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN)技術；轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALEN)技術；RNA引導的CRISPR-Cas核酸酶技術(CRISPR-CasRGNs)。目前十二頁\總數四十一頁\編于十三點1.ZFN基因組編輯技術ZFN技術是第一代基因組編輯技術，其功能的實現是基于具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白發展起來的。1986年Diakun等首先在真核生物轉錄因子家族的DNA結合區域發現了Cys2-His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內切酶。2005年，Urnov等發現一對由4個鋅指連接而成的ZFN可識別24bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應用。目前十三頁\總數四十一頁\編于十三點ZFN由鋅指蛋白(ZFP)和FokⅠ核酸內切酶組成。其中，由ZFP構成的DNA識別域能識別特異位點并與之結合，而由FokⅠ構成的切割域能執行剪切功能，兩者結合可使靶位點的雙鏈DNA斷裂(DSB)。于是，細胞可以通過同源重組(HR)修復機制和非同源末端連接(NHEJ)修復機制來修復DNA。HR修復有可能會對靶標位點進行恢復修飾或者插入修飾，而NHEJ修復極易發生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達到基因敲除的目的。目前十四頁\總數四十一頁\編于十三點ZFN誘導的基因組編輯技術可應用于很多物種及基因位點，具有較好的發展潛力。但是目前有3個方面的缺陷制約了該技術的推廣:(1)以現有的策略設計高親和性的ZFN，需要投入大量的工作和時間;(2)在細胞中持續表達ZFN對細胞有毒性;(3)雖然三聯體設計具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應。目前十五頁\總數四十一頁\編于十三點2.TALEN基因組編輯技術2009年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發現一種轉錄激活子樣效應因子，它的蛋白核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有較恒定的對應關系。隨后，TALE特異識別DNA序列的特性被用來取代ZFN技術中的鋅指蛋白。它可設計性更強，不受上下游序列影響，具備比ZFN更廣闊的應用潛力。目前十六頁\總數四十一頁\編于十三點TALENs包含兩個TALEN蛋白,每個TALEN都是由TALEarray與FokⅠ融合而成.其中一個TALEN靶向正義鏈上靶標位點,另一個則靶向反義鏈上的靶標位點.然后FokⅠ形成二聚體,在靶向序列中間的spacer處切割DNA,造成雙鏈DNA斷裂,隨后細胞啟動DNA損傷修復機制.針對不同的TALEN骨架,其最適宜的spacer長度不同,其長度范圍一般為12~20bp.實驗結果表明,TALENs在靶向DNA時,第一個堿基為T時其結合效果更佳。目前十七頁\總數四十一頁\編于十三點目前，TALEN已經成功應用于酵母、哺乳動物和植物的位點特異性基因打靶，與鋅指核酸酶系統相比有較大的應用優勢，但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應、TALEN與基因組進行特異結合與染色體位置及鄰近序列有關等。目前十八頁\總數四十一頁\編于十三點3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術1987年，Ishino等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發現串聯間隔重復序列，隨后發現這種間隔重復序列廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中。經過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復序列與細菌獲得性免疫的關系。目前十九頁\總數四十一頁\編于十三點在這個系統中，只憑借一段RNA便能識別外來基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012年，Jinek等第一次在體外系統中CRISPR/Cas9為一種可編輯的短RNA介導的DNA核酸內切酶，標志著CRISPR/Cas9基因組編輯技術成功問世。3.CRISPR/Cas9基因組編輯技術目前二十頁\總數四十一頁\編于十三點CRISPR/Cas系統由Cas9核酸內切酶與sgRNA構成.轉錄的sgRNA折疊成特定的三維結構后與Cas9蛋白形成復合體,指導Cas9核酸內切酶識別特定靶標位點,在PAM序列上游處切割DNA造成雙鏈DNA斷裂,并啟動DNA損傷修復機制.從不同菌種中分離的CRISPR/Cas系統,其CrRNA(或者是人工構建的sgRNA)靶向序列的長度不同,PAM序列也可能不同。目前二十一頁\總數四十一頁\編于十三點三種不同技術的比較目前二十二頁\總數四十一頁\編于十三點續表目前二十三頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯新技術的用途基因功能研究基因治療構建模式動物改造和培育新品種目前二十四頁\總數四十一頁\編于十三點1.基因功能研究基因敲除是在活體動物上驗證基因功能必不可少的邏輯環節，但是傳統的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、ES細胞篩選、嵌合體動物模型選育等一系列步驟，成功率受到多方面因素的限制。目前二十五頁\總數四十一頁\編于十三點1.基因功能研究即使對于技術比較成熟的實驗室，利用傳統技術敲除大鼠或小鼠身上的某個基因一般也需要1年以上。基因編輯新技術則不然，敲除基因高效快速，是研究基因功能的有力工具。目前二十六頁\總數四十一頁\編于十三點1.基因功能研究ZFN技術已在大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥、玉米、煙草等模式生物或經濟物種的細胞或胚胎中以及包括誘導多能干細胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)在內的人體外培養細胞系中成功地實現了內源基因的定點突變，其中在果蠅、斑馬魚、大鼠等物種中還獲得了可以穩定遺傳的突變體。目前二十七頁\總數四十一頁\編于十三點1.基因功能研究2009年，威斯康辛醫學院、SangamoBiosciences、Sigma-Aldrich等多家機構使用ZFN技術，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且帶有該突變的大鼠所生育的后代同樣帶有該基因突變。目前二十八頁\總數四十一頁\編于十三點2.基因治療傳統的基因治療是將正常的基因片段引入細胞中替代有缺陷的基因，但這種方法難以精準控制，可能產生很大的毒副作用。基因編輯新技術可以精確定位，在靶位點進行修正或進行基因切除，達到基因治療的目的。目前二十九頁\總數四十一頁\編于十三點2.基因治療Bacman等人利用TALEN技術清除了來自于病人線粒體內的有病DNA。這是TALEN首次應用于線粒體基因的編輯，這項研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。目前三十頁\總數四十一頁\編于十三點2.基因治療Li等人利用ZFN技術能在染色體上精確定位的優勢，通過“剪切”和“粘貼”基因，在實驗小鼠體內實現了血友病治療，避免了傳統基因療法帶來的插入誘變風險，首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。目前三十一頁\總數四十一頁\編于十三點3.構建模式動物根據人類疾病所構建的動物模型，對研究這些疾病的發生及其治療有著重要意義。基因打靶技術是在ES和同源重組技術的基礎上發展起來的，模型構建耗時長、成本高，且模式動物的選擇受到ES細胞的限制。目前三十二頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯新技術不受ES細胞的限制，效率高，速度快，且定點編輯更加精確，可在多種細胞及生物體的特定位點進行切割和修飾。構建轉基因小鼠第一人Jaenisch與其同事最近利用CRISPR-Cas系統又構建了攜帶特異性突變的小鼠模型。3.構建模式動物目前三十三頁\總數四十一頁\編于十三點4.改造和培育新品種傳統的改造動植物品種的轉基因技術是將外源DNA片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達優良的性狀，獲得人類需要的品種。基因編輯技術則可以進行定點修飾，達到高效定向。目前三十四頁\總數四十一頁\編于十三點Shukla等對玉米進行肌醇磷酸激酶1(inositolphosphatekinase1，IPK1)基因的修飾，使其對除草劑的耐性增強，在發育的種子中肌醇磷酸鹽表達譜也發生了與預期一樣的改變。Townsend等以煙草中的丙酮醇合酶(acetolactatesynthase)基因SuR

(SuRA和SuRB)位點為靶標，育成了對咪唑啉酮(imidazolinone)除草劑和對磺脲(sulphonylurea)除草劑都有抵抗力的新品種。目前三十五頁\總數四十一頁\編于十三點基因編輯的不足基因編輯是一項新技術，還存在構建復雜和價格的問題，其脫靶效應限制了其在基因治療等應用上的發展。目前三十