關于實驗一蛋白質含量測定考馬斯亮藍染色法第1頁，課件共31頁，創作于2023年2月Pleasebequiet,上課了！！第2頁，課件共31頁，創作于2023年2月

1、學習利用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質含量的原理及方法；

2、掌握分光光度計的使用方法；

3、掌握標準曲線的繪制。

一、實驗目的：第3頁，課件共31頁，創作于2023年2月

考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中游離狀態下為棕紅色。當它與蛋白質通過范德華鍵結合后變為藍色.

蛋白質染料復合物對595nm可見光有最大光吸收.

在一定范圍內（10-1000ug/ml）其OD595nm值與蛋白質含量成正比，故可用分光光度法進行蛋白質的定量測定。二、實驗原理：第4頁，課件共31頁，創作于2023年2月考馬斯亮藍G-250染色法原理465nm595nm酸性環境下呈棕紅色與蛋白質結合變藍色加入蛋白質第5頁，課件共31頁，創作于2023年2月雙縮脲反應：Folin-酚試劑法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凱式定氮法：其他蛋白質含量的測定方法第6頁，課件共31頁，創作于2023年2月（1）雙縮脲法：

原理是蛋白質含有兩個以上的肽鍵（-CO-NH-）因此，有雙縮脲反應，在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫色絡合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，故可以用來測定蛋白質含量.第7頁，課件共31頁，創作于2023年2月（2）Folin-酚試劑法（Lowry法）：

是雙縮脲法的發展，第一步涉及到堿性溶液中銅蛋白質復合物的形成，然后這個復合物還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑，產生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）比雙縮脲法靈敏，但費時；

第8頁，課件共31頁，創作于2023年2月（3）紫外吸收法：

蛋白質中Trp，Phe，Tyr的殘基中的苯環含有共軛雙鍵，吸收高峰在280nm處，所以蛋白質具有吸收紫外光的性質，并且蛋白質溶液的光吸收值與其含量成正比，可用作定量測定。簡單、靈敏、快速、不耗樣品，低濃度的鹽類不干擾。

第9頁，課件共31頁，創作于2023年2月（4）微量凱式定氮法：

根據蛋白質的平均含氮量為16%，因此，測得1g蛋白氮，相當于6.25g蛋白質。

第10頁，課件共31頁，創作于2023年2月

1、實驗材料：豆芽

2、儀器：(1)S-22pc可見光分光光度計(2)研缽

(3)離心機(4)試管(5)容量瓶等

3、試劑：（1）染色液：考馬斯亮藍G-250

(100mg考馬斯亮藍溶于50ml95%乙醇，加100ml85%磷酸，加水稀釋至1L)（2）濃度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白標準溶液。三、實驗材料、儀器和試劑：第11頁，課件共31頁，創作于2023年2月1、制作標準曲線：

取7支試管，依次分別加入0.0，0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水補足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即搖勻，置室溫下放置5分鐘。然后測各管的OD595nm值，繪制標準曲線。四、實驗步驟：

第12頁，課件共31頁，創作于2023年2月制作標準曲線：

編號1(空白）234567樣品標準蛋白

(ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml

水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0濃度(mg/ml)0.00.050.0750.10.150.20.25C0染色液(ml)55555555OD值第13頁，課件共31頁，創作于2023年2月標準蛋白質濃度OD值0樣品OD值C00.050.0750.1

0.150.20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6

標準曲線的制作（圖）y=ax+bR2=第14頁，課件共31頁，創作于2023年2月標準曲線的繪制目的：得到樣品中蛋白質的濃度。首先，用一組已知濃度的蛋白質溶液與考馬斯亮藍G-250反應,然后在595nm處測定吸光度（OD）。其次，繪制濃度與吸光度對應的曲線圖。最后，測定樣品蛋白質的吸光度然后在曲線上找到對應的濃度。第15頁，課件共31頁，創作于2023年2月

稱取豆芽葉片2g→研缽中加2ml水→研成勻漿→轉入離心管→用水分三次沖洗研缽，每次2ml→均轉入同一離心管→等重后4000轉/分離心15分鐘→取上清液轉入25ml容量瓶→定容。2、樣品蛋白質提取：第16頁，課件共31頁，創作于2023年2月

吸取0.5ml提取液于試管中,加入考馬斯亮藍G-250染色劑5ml，充分混勻，放置5分鐘，測OD595nm，記錄結果，查曲線，得蛋白質濃度C0(mg/ml)。3、測定：第17頁，課件共31頁，創作于2023年2月分光光度技術

利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質進行定性定量分析和物質結構分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術，使用的儀器稱為分光光度計.

紅外吸收光譜：波長范圍2.51000m,主要用于有機化合物結構鑒定。紫外吸收光譜：波長范圍200400nm（近紫外區）可用于結構鑒定和定量分析。可見吸收光譜：波長范圍400750nm，主要用于溶液等的定量分析。第18頁，課件共31頁，創作于2023年2月

朗伯—比爾(Lambert-bee)光吸收定律：A＝lg（I0/It)＝-lgT＝εbc（1）A—吸光度“OD”：描述溶液對光的吸收程度；同一種溶液對不同波長光的吸光度是不相同的，在吸光度最大處所對應的波長稱為最大光吸收處。同一種物質不同濃度的吸光度，在某一定波長下有差異，在最大光吸收處吸光度的差異最大。這是分光光度法進行物質定量分析的重要依據。I0：表示入射光強度，It：表示光線通過溶液后的強度。光吸收定律：第19頁，課件共31頁，創作于2023年2月（2）T—透光度：描述入射光透過溶液的程度；

（3）ε—摩爾吸光系數(是溶液的特征常數)，在數值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；單位mol·L－1；（4）b—樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地，b=1cm（5）C—樣品濃度（mol/L）由上式可以看出：吸光度OD與物質的濃度“C”和溶液吸光的厚度成正比。A＝lg（I0/It)=-lgT＝εbc

第20頁，課件共31頁，創作于2023年2月

分光光度計的組成和構造：（1）光源；（2）單色器（3）吸收池；（4）接收檢測放大系統(檢測器)；（5）信號指示系統(顯示或記錄器)。第21頁，課件共31頁，創作于2023年2月

⑴光源：

用于可見光光源是鎢燈和鹵鎢

，現在最常用的是鹵鎢燈（Halogenlamp），適用波長范圍是320～1100nm。用于紫外光區的是氫燈和氘燈適用波長范圍是195～400nm。第22頁，課件共31頁，創作于2023年2月⑵單色器：單色器是分光光度計的心臟部分。把來自光源的混合光波分解為單一波長的光能隨意改變光的波長。單色器一般由入射狹縫、準光器（透鏡或凹面反射鏡使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狹縫等幾部分組成。其核心部分是色散元件:主要是棱鏡和光柵第23頁，課件共31頁，創作于2023年2月⑶吸收池吸收池（即比色杯）：用來盛裝被測試的溶液。光學比色杯和石英比色杯兩種。光學比色杯適用波長范圍是400nm～2000nm，只能用于可見光。石英比色杯可透過紫外光、可見光和紅外光，是最常使用的吸收池，使用波長范圍是180nm～3000nm。光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容積3ml）第24頁，課件共31頁，創作于2023年2月比色杯使用注意事項：①比色杯在使用前后都要徹底的清洗。②嚴禁用手指觸摸透光面，因指紋不易洗凈。③嚴禁用硬紙和布擦拭透光面，只能使用鏡頭紙和綢布。④嚴禁加熱烘烤。急用干的杯子時，可用酒精蕩洗后用冷風吹干。決不可用超聲波清洗器清洗。

第25頁，課件共31頁，創作于2023年2月⑷檢測器：檢測器是一種光電轉換設備，即把光強度以電訊號顯示出來，常用的檢測器有光電管，光電倍增管和光電二極管等。

⑸顯示裝置：分光光度計現在已都使用數字顯示，有的還連有打印機。高性能分光光度計均可以連接微機，而且有的主機還使用帶液晶或CRT熒屏顯示的微處理機和打印繪圖機，有的還帶有標準軟驅，存取數據更加方便。第26頁，課件共31頁，創作于2023年2月偏離朗伯—比耳定律的原因

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發現：標準曲線常發生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學性因素。第27頁，課件共31頁，創作于2023年2月（1）物理性因素

難以獲得真正的純單色光。

朗伯—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。

非單色光、雜散光、散射光和反射光、非平行入射光都會引起對Beer-Lambert定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

第28頁，課件共31頁，創作于2023年2月(2)化學性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質點之間不發生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。當溶液濃度c>10－2mol/L時，溶液中溶質可因濃度改變而有離解、締合、互變異構、配合物的形成和與溶劑間的作用，使吸光質點的濃度發生變化，影響吸光度。

例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：CrO42-＋