關于實驗一大腸桿菌的分離和培養第1頁，課件共25頁，創作于2023年2月實驗目的：1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養基進行細菌培養的操作。2.進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養基本進行細菌的劃線培養。3.說明大腸桿菌培養的條件和實驗原理。第2頁，課件共25頁，創作于2023年2月一、基礎知識(一)微生物:1.特點：結構都相當簡單,個體多數十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.且體內一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.2.微生物包括五類病毒細菌放線菌真菌原生動物第3頁，課件共25頁，創作于2023年2月(二)培養基1.分類(按物理形態分)(1)液體培養基(2)固體培養基常用的固體培養基:

瓊脂固體培養基.②微生物在固體培養基表面生長,可以形成肉眼可見的菌落.第4頁，課件共25頁，創作于2023年2月2.培養基內所含的基本物質(1)水(2)碳源(3)氮源(4)無機鹽第5頁，課件共25頁，創作于2023年2月3.培養基內所需的其他條件(1)pH值如:培養霉菌需酸性、培養細菌需中性或微堿性(2)特殊營養物質----?如：培養乳酸桿菌需要在培養基中添加維生素(3)氧氣的含量如:培養厭氧微生物時需要提供無氧的條件生長因子第6頁，課件共25頁，創作于2023年2月(三)無菌技術1、獲得純凈培養物的關鍵:2、無菌技術的四個方面(參看教材20頁)3、消毒與滅菌(1)消毒：概念：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物。包括芽孢和孢子嗎？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化學藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外線消毒(不包括芽孢和孢子)防止外來雜菌的入侵第7頁，課件共25頁，創作于2023年2月（2）滅菌概念：使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼燒滅菌b

干熱滅菌c

高壓蒸汽滅菌灼燒滅菌微生物的接種工具(接種環、接種針)或其他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒注意適用范圍第8頁，課件共25頁，創作于2023年2月干熱滅菌

160－170℃；1－2h能耐高溫的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)高壓蒸汽滅菌100kPa121℃15-30min通常用于培養基的滅菌第9頁，課件共25頁，創作于2023年2月二、實驗操作（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養基計算－稱量－溶化－滅菌－倒平板（二）分離純化大腸桿菌接種方法有：劃線分離法和涂布分離法（三）將接種后的培養基和一個未接種的培養基放入37℃恒溫箱中培養12h和24h后，觀察并記錄第10頁，課件共25頁，創作于2023年2月三、課題延伸：菌種的保藏1、斜面保藏（臨時保存）2、甘油保藏（長期保存）第11頁，課件共25頁，創作于2023年2月實驗1：大腸桿菌的培養和分離設備及用品：滅菌鍋或高壓鍋、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm的培養皿、接種環和玻璃三角刮刀、恒溫培養箱、搖床、酒精燈和超凈臺、一次性塑料手套、裝有酒精棉球的廣口瓶、鑷子、有棉塞的試管（15mm×120mm）5支實驗材料：(1)50mlLB液體培養基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml。(2)大腸桿菌菌種斜面(3)空白斜面

第12頁，課件共25頁，創作于2023年2月實驗步驟(1)滅菌：將配制好的50mlLB液體培養基和50mlLB液體培養基分別裝入兩個250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高壓鍋進行滅菌。(2)制平板：在酒精燈火焰旁將固體培養基分別倒在4個培養皿中，使培養基鋪平皿底部，待凝，使之形成平面。(3)接種擴大培養：靠近酒精燈火焰將大腸桿菌接種到三角燒瓶的液體培養基中，三角燒瓶在37℃搖床振蕩培養12h。(4)劃線分離：將搖床上培養12h的菌液在固體培養基的平板上連續劃線，然后將蓋好的培養皿倒置，放在37℃恒溫培養箱中進行培養。(5)單菌落接種培養：在無菌操作下將單菌落用接種環取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37℃下培養24h,4℃冰箱保存。第13頁，課件共25頁，創作于2023年2月單菌落第14頁，課件共25頁，創作于2023年2月實驗討論

實驗完成后，接觸過細菌的器皿應如何處理？實驗完成后，所有接觸過細菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養基，有可能被有害菌體污染，在培養繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30min,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。第15頁，課件共25頁，創作于2023年2月無菌技術的四個方面（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；（2）將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。(三)無菌技術返回第16頁，課件共25頁，創作于2023年2月倒平板第17頁，課件共25頁，創作于2023年2月討論:(1).培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？(2).為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？(3).平板冷凝后，為什么要將平板倒置？(4).在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？提示：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。返回第18頁，課件共25頁，創作于2023年2月1、平板劃線法第19頁，課件共25頁，創作于2023年2月討論:(1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？(2).在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？(3).在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。返回第20頁，課件共25頁，創作于2023年2月2.稀釋涂布法:(1)系列稀釋操作:第21頁，課件共25頁，創作于2023年2月涂布平板操作討論:涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？提示：應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。返回第22頁，課件共25頁，創作于2023年2月返回菌落：單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態結構的子細胞群體，叫做菌落。不同的細菌的菌落特征不同菌落是鑒定菌種的重要依據。第23頁，課件共25頁，創作于2023年2月(2)碳源可作為碳源的物