轉基因動物方法簡介動物轉基因方法簡介轉基因動物就是基因組中含有外源基因的動物。它是按照預先的設計，通過細胞融合、細胞重組、遺傳物質轉移、染色體工程和基因工程技術將外源基因導入精子、卵細胞或受精卵，再以生殖工程技術，有可能育成轉基因動物。原核顯微注射法（原核期細胞：受精卵的兩個核未融合時期的細胞）目前最常用的轉基因動物生產方法，又稱DNA顯微注射法，即通過顯微操作儀將外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，發育成轉基因動物。其創始人是Jaenisch和Mintz等。Gordon等和Palmiter等先后通過此方法獲得轉基因動物。此方法目前應用較普遍，現在的轉基因動物研究大都是在Palmiter等方法的基礎上有所改進而進行的。王敏華(1996)報道用顯微注射法轉移抗瘟病毒核酸酶基因，獲得了轉基因兔。KrimPenfort運用體外培養胚胎再施用顯微注射法獲得了轉基因牛。這種方法的特點是外源基因的導入整合效率較高，不需要載體，直接轉移目的基因。它可以直接獲得純系（應該也不一定，如上述魚的情況），所以實驗周期短。但需要貴重精密儀器，技術操作較難，并且外源基因的整合位點和整合的拷貝數都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應的性狀改變，重則致死。外源基因整合到受體基因組的時機，將決定轉基因動物是否發育成嵌合體，如整合發生在第一次卵裂前，即發生在DNA合成的S期，外源基因將隨染色體的分離均勻的分布到每一個細胞，得到的轉基因動物是純合體，反之，得到的將是嵌合體。顯微注射轉基因的實踐證明，受精卵DNA合成的S期是顯微注射的適宜時機。但由于整合需要一段時間，等目的基因整合至染色體后，受精卵早已分裂多次，故很難得到純合體。如魚類在原腸胚早期才開始整合，而此時細胞已多值幾千，此時轉植基因在每個細胞內的整合情況不可能一致，所以第一代轉基因魚總是嵌合體。哺乳動物受精卵的單細胞期階段較長，還有可能得到純合體的轉基因動物。也可在囊胚期進行，得到的是嵌合體轉基因動物胚胎干細胞（EmbryonicStemCell，簡稱ES細胞）介導法是將基因導入胚胎干細胞；然后將轉基因的胚胎干細胞注射于動物囊胚后可參與宿主的胚胎構成，形成嵌合體，直至達到種系嵌合。因此，可以將其作為一種載體，導入外源基因，獲得轉基因動物。即從早期胚胎的內細胞團經過體外培養建立起來的多潛能細胞系。其優點是：在將胚胎干細胞植入胚胎前，可以在體外選擇一個特殊的基因型：用外源DNA轉染以后，胚胎干細胞可以被克隆，繼而可以篩選含有整合外源DNA的細胞用于細胞融合，由此可以得到很多遺傳上相同的轉基因動物。缺點就是許多嵌合體轉基因動物生殖細胞內不含有轉基因;。目前，胚胎于細胞介導法在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚。Evans等（1981）用不同培養系統從小鼠囊胚的內細胞團分離并建立了多潛能干細胞克隆系；Stice和Strelchenko等（1996）獲得了牛的胚胎干細胞。注意：DNA顯微注射和胚胎顯微注射的區別1胚胎顯微注射得到嵌合體小鼠。DNA顯微注射得到轉基因小鼠。+f8I+X/l'V5s8Z%[2胚胎顯微注射是把是把轉化/轉導了目的基因的胚胎干注射到囊胚逆轉錄病毒載體法將目的基因重組到逆轉錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養細胞共孵育以達到感染的目的，通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。通過此方法，Slater等得到了轉基因雞，Haskell得到了轉基因牛。這種逆轉錄病毒被用重組DNA技術修飾后作為基因載體在應用中優于微注射法之處為：無需要重排，可在整合點整合轉移基因的單個拷貝；將胚胎置于高濃度病毒容器中，或者與被感染的細胞體外共同培養，或微注射雞胚盤里，整合有逆轉錄病毒的DNA的胚胎率高。缺點是：需要生產帶有轉基因的逆轉錄病毒；插入逆轉錄病毒的基因有一定的大小限度；所得轉基因家畜的嵌合性很高，而需要廣泛的雜交，以建立轉基因系；轉基因的表達問題尚未解決。精子介導的基因轉移精子介導的基因轉移是把精子作適當處理后，使其具有攜帶外源基因的能力。然后，用攜帶有外源基因的精子給發情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的動物是整合外源基因的轉基因動物。同顯微注射方法相比，精子介導的基因轉移有兩個優點：首先是它的成本很低，只有顯微注射法成本的1/10。其次，由于它不涉及對動物進行處理，因此，可以用生產牛群或羊群進行實驗，以保證每次實驗都能夠獲得成功。核移植轉基因法體細胞核移植是近年來新出現的一種轉基因技術。該方法是先把外源基因與供體細胞在培養基中培養，使外源基因整合到供體細胞上，然后將供體細胞細胞核移植到受體細胞——去核卵母細胞，構成重建胚，再把其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉基因的克隆動物。體細胞核移植法先在體外培養的體細胞中進行基因導入，篩選獲得帶轉基因的細胞。然后，將帶轉基因體細胞核移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產重構胚胎。重構胚胎經移植到母體中，產生的仔畜百分之百是轉基因動物。線粒體介導法由于轉基因動物受遺傳鑲嵌性和雜合性的影響，其有性生殖后代變異較大，難以形成穩定遺傳的轉基因品系。因