細胞生物學研究方法演示文稿1目前一頁\總數九十六頁\編于二十一點2優選細胞生物學研究方法目前二頁\總數九十六頁\編于二十一點一、光學顯微鏡技術（lightmicroscopy

普通復式光學顯微鏡技術

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LaserConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）微分干涉顯微鏡（differential-interferencemicroscope）錄像增差顯微鏡技術（video-enhancemicroscopy）目前三頁\總數九十六頁\編于二十一點普通復式光學顯微鏡技術

分辨率（即分辨極限,D）是指區分開兩個質點間的最小距離.習慣說的分辨率高則是指該分辨極限小；人眼的分辨率：100m，光學顯微鏡的最大分別率：0.2m.放大倍數:光學顯微鏡在用空氣作介質時,最大放大倍數為1000倍,用油鏡時為1400倍.目前四頁\總數九十六頁\編于二十一點目前五頁\總數九十六頁\編于二十一點熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）原理與應用

直接熒光標記技術

間接熒光標記技術（熒光免疫）

在光鏡水平用于特異蛋白質等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

目前六頁\總數九十六頁\編于二十一點目前七頁\總數九十六頁\編于二十一點目前八頁\總數九十六頁\編于二十一點目前九頁\總數九十六頁\編于二十一點激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像。經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，能顯示細胞樣品的立體結構。圖1圖2目前十頁\總數九十六頁\編于二十一點laserconfocalscanningmicroscope,LCSM目前十一頁\總數九十六頁\編于二十一點LCSMImageofaXenopusMelanophore目前十二頁\總數九十六頁\編于二十一點用激光共聚焦顯微鏡看到的各種細胞目前十三頁\總數九十六頁\編于二十一點暗視野顯微鏡

darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野背景是黑的，物體邊緣是亮的。可觀察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。目前十四頁\總數九十六頁\編于二十一點目前十五頁\總數九十六頁\編于二十一點把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處:環形光闌：位于光源與聚光器之間。相位板：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞。相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年發明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。圖相差顯微鏡目前十六頁\總數九十六頁\編于二十一點用途：觀察未經染色的玻片標本目前十七頁\總數九十六頁\編于二十一點不同顯微鏡下細胞目前十八頁\總數九十六頁\編于二十一點二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術超薄切片技術負染色技術冰凍蝕刻技術電鏡三維重構技術

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）1932年德國學者MaxKnolls和ErnstRuska用波長比光短得多的電子作光源,發明了第一臺電子顯微鏡，大大提高了顯微鏡的分辨率，開拓了超微世界。目前十九頁\總數九十六頁\編于二十一點

電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區別

分辨本領

光

源

透

鏡

真

空

成像原理

人眼

100m

可見光

光學顯微鏡

0.2m

可見光

(波長400～700nm)

利用樣本對光的吸收形成明暗反差和顏色變化

0.1m

紫外光

玻璃透鏡

不要求真空

電子顯微鏡

接近0.1nm

電子束

(波長0.01～0.9nm)電磁透鏡

1.33×10-5～1.33×10-3Pa

利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差

目前二十頁\總數九十六頁\編于二十一點電鏡與光鏡光路圖比較光源聚光鏡樣品物鏡目鏡直接成像電源聚光鏡樣品物鏡目鏡熒光屏上觀察圖象電源透鏡透鏡樣品熒光屏上觀察圖象射線掃描器光學顯微鏡透射電鏡掃描電鏡目前二十一頁\總數九十六頁\編于二十一點電子顯微鏡的基本構造目前二十二頁\總數九十六頁\編于二十一點透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM目前二十三頁\總數九十六頁\編于二十一點主要電鏡制樣技術超薄切片技術用于電鏡觀察的樣本制備示意圖

負染色技術（Negativestaining）圖 染色背景，襯托出樣品的精細結構 冰凍蝕刻技術（Freezeetching）技術示意圖 冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面 的蛋白質顆粒和膜表面結構。電鏡三維重構技術 電子顯微術、電子衍射與計算機圖象處理相結合 而形成的具有重要應用前景的一門新技術。 電鏡三維重構技術與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技 術相結合，是當前結構生物學——主要研究生物大分子空間結 構及其相互關系的主要實驗手段。目前二十四頁\總數九十六頁\編于二十一點電鏡樣品的制備目前二十五頁\總數九十六頁\編于二十一點負染色技術用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方沒有染料沉積，從而出現負染效果，分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria目前二十六頁\總數九十六頁\編于二十一點目前二十七頁\總數九十六頁\編于二十一點掃描電鏡（SEM）原理與應用：

掃描電子顯微鏡于20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結構。工作原理是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變為光信號，再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。圖1圖2圖3圖4目前二十八頁\總數九十六頁\編于二十一點目前二十九頁\總數九十六頁\編于二十一點Scanningelectronmicroscope（SEM）目前三十頁\總數九十六頁\編于二十一點人類血細胞SEM照片圖片來自目前三十一頁\總數九十六頁\編于二十一點酵母目前三十二頁\總數九十六頁\編于二十一點人類精子目前三十三頁\總數九十六頁\編于二十一點三、掃描隧道顯微鏡原理：量子力學中的隧道效應特點：（1）分辨本領高，（側分辨率為0.1～0.2nm， 縱分辨率可達0.001nm）； （2）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作； （3）非破壞性測量樣品的完整外貌。用途：納米生物學研究領域中的重要工具目前三十四頁\總數九十六頁\編于二十一點STMimageofaDNAmolecule目前三十五頁\總數九十六頁\編于二十一點第二節細胞組分的分析方法

離心分離技術

細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細胞內特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術

定量細胞化學分析技術目前三十六頁\總數九十六頁\編于二十一點一、離心分離技術

用途：

離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體等細胞器，以及各種大分子基本手段。一般認為，轉速為10000-25000r/min的離心機稱為高速離心機；轉速超過25000r/min，離心力大于89Kｇ者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉速可達80000r/min，離心力超過500Kg。

差速離心密度梯度離心

目前三十七頁\總數九十六頁\編于二十一點（一）、差速離心在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、最后為核蛋白體。目前三十八頁\總數九十六頁\編于二十一點（二）、密度梯度離心用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。目前三十九頁\總數九十六頁\編于二十一點速度沉降主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種沉降方法所采用的介質密度較低，介質的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。等密度沉降適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續梯度的介質中經足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。目前四十頁\總數九十六頁\編于二十一點二、細胞內核酸、蛋白質、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質中一些特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量。目前四十一頁\總數九十六頁\編于二十一點1.Schiff反應：分子中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變為紫紅色。這種反應通常用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）.DNA的福爾根反應2.脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。3.茚三酮反應：顯示蛋白質。4.金屬沉淀法：利用金屬化合物在反應過程中生成有色沉淀，借以辨認所檢查的物質或酶活性。如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。目前四十二頁\總數九十六頁\編于二十一點目前四十三頁\總數九十六頁\編于二十一點三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術：根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，并標上標記熒光素，對抗原進行定位測定的技術。快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。蛋白電泳(SDS）與免疫印跡反應(Western-Blot)免疫電鏡技術：能有效提高樣品的分辨率，在超微結構水平上研究特異蛋白抗原的定位。免疫鐵蛋白技術免疫酶標技術免疫膠體金技術

應用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態；胞內酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等目前四十四頁\總數九十六頁\編于二十一點四、細胞內特異核酸的定位與定性光鏡水平的原位雜交技術:同位素標記或熒光素標記的探針電鏡水平的原位雜交技術:生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結合PCR技術聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）在體外將目標DNA大量擴增,以便分析.

目前四十五頁\總數九十六頁\編于二十一點人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片目前四十六頁\總數九十六頁\編于二十一點六．定量細胞化學分析技術

流式細胞儀（FlowCytometry）主要應用：用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量； 測定細胞群體中不同時相細胞的數量； 從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； 分離DNA含量不同的中期染色體。

目前四十七頁\總數九十六頁\編于二十一點其主要工作原理是：經熒光染色的單細胞懸液被高壓壓入流動室內，在PBS或生理鹽水等殼液(SheathFluid)的包裹和推動下形成單細胞狀態，并以每分鐘5000—10000個細胞的高速度從流動室內噴出。在與細胞束呈90°角的方向，受到來自氬離子激光器的激光束照射而激發熒光。通過各種物鏡及濾光片將從不同角度收集的熒光投射到光電倍管并轉換為各種強弱不等的電脈沖信號顯示出來。這些信號輸到電子計算機中貯存，經處理和分析便可得到多種信息參數。進行細胞分類時，根據需要對含細胞的水滴選擇性充電，在帶有高電壓的偏轉板作用下，帶正電荷的水滴落入左方收集管內，帶負電荷的水滴落入右方收集管內，不帶電荷的水滴進入中間的收集管。分類主要根據細胞的熒光強度，即單細胞DNA含量。圖目前四十八頁\總數九十六頁\編于二十一點流式細胞術

流式細胞術目前四十九頁\總數九十六頁\編于二十一點細胞顯微分光光度術

原理：細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長為260nm，而蛋白質的則為280nm。有的成分經組織化學染色后，對可見光有特定的吸收光譜。

應用：根據細胞成分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性，甚至定量測定。

目前五十頁\總數九十六頁\編于二十一點第三節細胞培養、細胞工程與顯微操作技術

細胞的培養

細胞工程目前五十一頁\總數九十六頁\編于二十一點一、細胞的培養

動物細胞培養 類型：原代培養細胞 繼代培養細胞

細胞株

細胞系

植物細胞

類型： 原生質體培養（體細胞培養）

單倍體細胞培養（花藥培養）非細胞體系目前五十二頁\總數九十六頁\編于二十一點原代培養（primaryculture）：也叫初代培養，指直接從體內取出的細胞、組織和器官進行的第一次的培養物。一旦已進行傳代培養（subculture）的細胞，便不再稱為原代培養，而改稱為細胞系。傳代（passage）：將細胞從一個培養瓶轉移到另外一個培養瓶即稱為傳代或傳代培養。培養細胞的“一代”，不表示細胞分裂一次，而是指培養細胞從接種到再次轉移培養的過程。在一次傳代培養中，細胞能倍增3-6次。目前五十三頁\總數九十六頁\編于二十一點細胞系（cellline）：原代培養物成功傳代后，則稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（finitecellline）；已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系，稱連續細胞系或無限細胞系（infinitecellline）。無限細胞系大多已發生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質上已是發生轉化的細胞系。無限細胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性。細胞株（cellstrain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物稱為細胞株。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養期間始終存在。再由原細胞株進一步分離培養出與原株性狀不同的細胞群，亦可稱之為亞株（substrain）。目前五十四頁\總數九十六頁\編于二十一點Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養目前五十五頁\總數九十六頁\編于二十一點

二、細胞工程細胞融合與細胞雜交技術圖單克隆抗體（monocloneantibody）技術圖細胞拆合與顯微操作技術物理法結合顯微操作技術圖1

圖2轉基因技術圖化學法結合離心技術制備核體和胞質體。

細胞生命活動的研究主要方向？目前五十六頁\總數九十六頁\編于二十一點細胞融合通過培養和誘導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cellfusion）或細胞雜交（cellhybridization）。目前五十七頁\總數九十六頁\編于二十一點單克隆抗體技術1目前五十八頁\總數九十六頁\編于二十一點目前五十九頁\總數九十六頁\編于二十一點顯微操作儀目前六十頁\總數九十六頁\編于二十一點圖2-18尼康NT-88NE顯微操作/注射儀目前六十一頁\總數九十六頁\編于二十一點轉基因顯微操作過程

目前六十二頁\總數九十六頁\編于二十一點目前六十三頁\總數九十六頁\編于二十一點第四節細胞及生物大分子的動態變化一、熒光漂白恢復技術

用來檢測活細胞表面活細胞內部生物大分子的運動及速度熒光標記→熒光淬滅（漂白）→熒光恢復目前六十四頁\總數九十六頁\編于二十一點二、放射自顯影技術原理及應用：利用同位素的放射自顯影，對細胞內生物大分子進行定性、定位與半定量研究；實現對細胞內生物大分子進行動