熱烈歡迎各位蒞臨本次學(xué)術(shù)講座MicroRNA轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究及SCI論文策略

主辦：湖南省生物醫(yī)學(xué)信息專業(yè)委員會湖南省贏通基因與細胞工程技術(shù)研究中心

生物醫(yī)藥科研網(wǎng)承辦：贏潤生物重慶邁凱科技有限公司能潤醫(yī)學(xué)MicroRNA研究策略贏潤生物2011年12月講座主線MicroRNA簡介MicroRNA的檢測MicroRNA的過表達如何下調(diào)MicroRNAMicroRNA靶基因驗證實驗MicroRNA相關(guān)SCI論文實例一.MicroRNA簡介兩個概念：pri-miRNApre-miRNAMaturemiRNAmiRNA的種子序列（seedsequence）：成熟miRNA的5’端的第2～8位核苷酸與靶mRNA3’端的非翻譯區(qū)（UTR）部分序列的結(jié)合很重要，被稱為種子序列。二.MicroRNA的檢測MicroRNA芯片優(yōu)點：高通量缺點：成本高；難區(qū)分前體miRNA和成熟miRNANorthernblot優(yōu)點：能比較直觀的反映miRNA的表達量高低缺點：步驟復(fù)雜；難區(qū)分前體miRNA和成熟miRNAmiRNAqPCR檢測（Real-timePCR）優(yōu)點：可區(qū)分前體miRNA和成熟miRNA；檢測靈敏度高；高特異性；成本較低難點：MaturemiRNA很短，如何檢測？解決方法：加長序列miRNAqPCR檢測：Stem-loop法miRNAqPCR檢測：PolyA加尾法Stem-loop法優(yōu)點：特異性高缺點：每做一次RT，只能檢測一個miRNA代表廠家：ABI、AmbionPolyA加尾法優(yōu)點：通用性高；一次RT可以檢測多個miRNA缺點：特異性稍差代表廠家：Qiagen三.MicroRNA的過表達pri-miRNApre-miRNAMaturemiRNA載體形式載體形式化學(xué)合成：mimicsCMV啟動子~600bp轉(zhuǎn)染效率高可長期表達可帶熒光U6/H1啟動子70~600bp可帶熒光可長期表達轉(zhuǎn)染效率高miRNA成熟序列價格較高價格較高可進行各種修飾可帶熒光作用時間短轉(zhuǎn)染效率有時較低價格較低pri-miRNA結(jié)構(gòu)：CMVp---EGFP---pri-miRNA---PolyApre-miRNA結(jié)構(gòu)：hU6p---pre-miRNA---TTTTTT人工pri-miRNA結(jié)構(gòu)：CMVp---EGFP---mir30左臂---pre-miRNA---mir30右臂---PolyApYr-pri-miRNA構(gòu)建用載體pYr-pri-miRNA范例pYr-pri-miRNA范例pYr-pri-miRNA構(gòu)建用載體pYr-pri-miRNA范例pYr-pri-miRNA范例pYr-跌pri-堤miRN碌A(chǔ)范例pYr驚-pr波i-m系iRN筍A范例人工pri仆-mi司RNA范例Tips：pri里-mi購RNA過表達，miRN立A能夠提升澡多少？（1）如果肥目的細寨胞中已營有miR府NA的高表達欠：大約提鴉升2~5倍。（2）如果瀉目的細愁胞中目柳的miR印NA低表達或隆無表達：大約能匹提升50~1蒸000倍。四.如何下印調(diào)Mic到roR疫NA如何下遷調(diào)miRN出A，實現(xiàn)loss閑-of-瘦func擋tion研究？（1）化學(xué)合幅成的miRN表Aan疑tise天nso辭ligo。優(yōu)點：絨比較經(jīng)昆濟；合鄉(xiāng)豐成時間漫較短缺點：勤作用時日間短；銜轉(zhuǎn)染效客率受限重制（2）載體形爬式的miR歉NA答inh湊ibi暗tor。優(yōu)點：獸可長期閣穩(wěn)定作腎用；轉(zhuǎn)此染效率遞高缺點：淹構(gòu)建周暑期較長如何構(gòu)覆建載體爆形式的miR妙NA擦inh田ibi宣tor方法一懂：miR暢NA戰(zhàn)spo咱ngemiR漆NA蹈spo圓nge作用效竟果如何構(gòu)建踢載體形式弊的miRN蹈Ain澤hibi依tor方法二：miRN宰ADe留coy（TuD壯RN什As）miRN辯ADe麗coy作用效果五.M抓icr賠oRN品A靶基因驗商證實驗prom監(jiān)oter報告基醫(yī)因miR飲NA靶序列CMVpSV40微pTKpRlucFlucEGF逮P全段3’U迅TR部分3’U排TRβ-g捉al檢測方約法（1）miR斑NA靶標(biāo)載體每、內(nèi)參熒光竭素酶載體鏡、miR狂NA暢mim眼ics或miR弓NA過表達顧載體共轉(zhuǎn)染。（2）帶有攻內(nèi)參熒淘光素酶冶的miRN笑A靶標(biāo)載體怎、miRN投Ami倒mics或miRN落A過表達載恰體共轉(zhuǎn)染。然后做雙鉛熒光素酶齡檢測實驗疊。進一步流確定目殼的miRN忍A和靶基獄因之間委的關(guān)系（1）構(gòu)建含堂突變靶位爛點的miR柄NA靶標(biāo)載劍體。其它步驟吊同前。（2）靶基已因表達儀檢測：目的miR孫NA上調(diào)或唐下調(diào)過純程中，葉靶基因小表達量坡的變化情險況。機制研究目的miR損NA靶基因細胞表型下游基器因六.Mi惠croR羨NA相關(guān)SCI論文實例SCI論文實您例一影響因子卻：2.8第一步強：通過啞預(yù)測軟畏件選取碌待選miR扁NA（58個）第二步直：構(gòu)建手待選miR醉NA的過表達截載體第三步：脫雙熒光素沃酶檢測實暴驗第四步：miRN蹦A對目的豆基因表追達量的安影響第五步：休進一步驗褲證miR旬-50幕3與CCN款D1的關(guān)系細胞表型泛水平的驗紫證：SCI論文實例密二影響因子然：8.1妖5第一步蠢：發(fā)現(xiàn)守組織和歇細胞中miR碼-20夜5表達差趁異第二步咽：過表狂達miR-罰205，發(fā)現(xiàn)沖細胞增疊殖受到尸抑制miR-筆205表達上調(diào)蓋后，腫瘤泥細胞的侵得襲能力下趣降第三步：踏選擇靶基原因，雙熒獲光素酶檢賴測實驗第四步孤：miR頁-20旨5上調(diào)對靶猶基因表達歌量的影響SCI論文實例私三影響因承子：~28第一步歇：針對泡目的基油因，選寬擇待選子的miR罩NA（軟件啞）最終選定miR發(fā)-10已1作為研墾究對象第二步汗：進一喘步實驗括驗證miR肯-10庸1和EZH2之間的關(guān)恩系（1）雙熒相光素酶逼檢測（2）過表達miR-茂101及其它幾設(shè)種miRN閥A，檢測EZH跳2表達West陽ern-示blot檢測第三步旺：研究miR-禁101、EZH肚2、細胞輩表型之涼間的關(guān)外系細胞增程殖：腫瘤細胞寇侵襲能力成瘤實倉驗第四步守：機制撥研究第五步：江結(jié)論Mic緊roR老NA研究思欠路之一Mic沈roR醫(yī)NA芯片檢測miRN伍AqP及CR檢測Nor電the胞rn檢測確定欲研價究的miR附NA選擇作用調(diào)的靶基因靶基因驗挑證實驗基因表比達檢測細胞表行型檢測miRN云A上調(diào)或僚下調(diào)組織或原細胞Micr軌oRNA研究思路死之二確定目辛的基因miRN縮慧AqP臂CR檢測Nor欣the愚r(nóng)n檢測確定欲膝研究的miRN坐A確定若干雁個目的miRN錦Amic排roR蝦NA芯片檢腫測miRN疾A上調(diào)或下交調(diào)靶基因頃驗證實隱驗基因表繳達檢測細胞表型角檢測數(shù)萬個cDNA克隆和ORF克隆；六百多種脫常用載體森及菌株；秘幾十種啟證動子數(shù)據(jù)尚鄭未完全噸錄入，脊請QQ、Ema通il或電話咨嘗詢。贏潤生叔物技術(shù)賭支持基因庫、照載體庫、RNA干擾、赴病毒包抗裝：孫永林（捏手機：155癥749崇268獸81；QQ：1269臂5920；Emai開l：serv受ice@煌yrge棟ne.c械om）分子生陣物學(xué)、鉆細胞生廳物學(xué)、紗蛋白質(zhì)套及免疫唱學(xué)：劉彩云休（手機喚：159慨731晶653求83；QQ：1588風(fēng)7251；Ema賤il：ord代er@三yrb勾io.款com受)贏潤技術(shù)頂服務(wù)重慶陽獨家代理中商——重慶邁音凱科技薄有限公晴司鄧顯鋒敲（手去機：1303辜6393拴306撒QQ：2858哄1806巾6）周輝云織（手遵機：1310禍2370朋501務(wù)QQ：7890潤4388）唐糟港（手癢機：1361數(shù)8257每190銜Q楊Q：492偵268束569）電話：023低-63許245野915翼E觸mai視l：biot家ree@忌163.批com歡迎您垂箏詢！Tha梅nks來!謝謝觀看/歡迎下名載BYF殃