微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課件演示文稿目前一頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)課件目前二頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)病毒幾乎可以感染所有的細(xì)胞生物，并具有宿主特異性噬菌體植物病毒動物病毒微生物基礎(chǔ)知識目前三頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)病毒培養(yǎng)動物接種雞胚接種（常用的病毒培養(yǎng)法之一）組織培養(yǎng)（應(yīng)用最廣的方法）微生物基礎(chǔ)知識目前四頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)一、基礎(chǔ)知識：（一）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定等。（2）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基的類型和用途目前五頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)培養(yǎng)基的種類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據(jù)物理性質(zhì)分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據(jù)化學(xué)成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基據(jù)用途分常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于觀察微生物的運(yùn)動、鑒定菌種用于微生物的分離、計數(shù)常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進(jìn)所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細(xì)菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細(xì)菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。目前六頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)固體培養(yǎng)基：菌落目前七頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長目前八頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)半固體培養(yǎng)基：無動力有動力(彌散)(是否運(yùn)動)

目前九頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)2、培養(yǎng)基配制原則：

（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因?yàn)椴煌奈⑸飳ε囵B(yǎng)物質(zhì)的需求不同。（2）營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。細(xì)菌pH為：；放線菌pH為：；真菌pH為：。目前十頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)3、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),例如:生長因子(即細(xì)菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。

目前十一頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)4、微生物的五種營養(yǎng)要素碳源（carbonsource）

氮源（nitrogensource）

生長因子（growthfactor）

無機(jī)鹽（mineralsalts）

水（wahtor）

Cncnc-micro目前十二頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)凡能為微生物提供生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為碳源。Cncnc-micro碳源目前十三頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)C素構(gòu)成細(xì)胞及代謝產(chǎn)物的骨架C素是大多數(shù)微生物代謝所需的能量來源自養(yǎng)微生物以二氧化碳或碳酸鹽為唯一碳源進(jìn)行代謝生長；異養(yǎng)微生物必須以有機(jī)物作為碳源進(jìn)行代謝生長。碳源是異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì)。碳源功能目前十四頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)無機(jī)C源：CO2、碳酸鹽，只能被自養(yǎng)微生物利用有機(jī)C源：各種糖類，其次是有機(jī)酸、醇類、脂類和烴類化合物碳源種類Cncnc-micro目前十五頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

凡是能為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為氮源。氮源Cncnc-micro目前十六頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

為微生物提供合成細(xì)胞物質(zhì)代謝產(chǎn)物的原料對許多微生物來說，既可利用無機(jī)態(tài)氮，也可利用有機(jī)態(tài)氮。

固氮微生物可以利用氮?dú)庾鳛榈催M(jìn)行生長。某些種類的氮源也能為微生物提供能量，如NH3既是硝化細(xì)菌的氮源又是能源，含C、H、O、N的蛋白質(zhì)等也能為微生物提供能量。氮源功能Cncnc-micro目前十七頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)分子態(tài)氮：固氮微生物以分子氮為唯一氮源無機(jī)態(tài)氮：硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用有機(jī)態(tài)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物

a實(shí)驗(yàn)室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源

b生產(chǎn)用玉米漿、豆餅、葵花餅、花生餅等氮源種類Cncnc-micro目前十八頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

構(gòu)成微生物細(xì)胞的組成成分調(diào)解微生物細(xì)胞的滲透壓，PH值和氧化還原電位有些無機(jī)鹽如S、Fe還可做為自養(yǎng)微生物的能源構(gòu)成酶活性基的組成成分，維持酶活性。Mg、Ca、K是多種酶的激活劑無機(jī)鹽無機(jī)鹽功能Cncnc-micro目前十九頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

構(gòu)成微生物細(xì)胞以C、H、O、N、P、S六種元素為主，約占細(xì)胞干重的95％以上；

Ca、K、Mg、Fe為大量元素，以無機(jī)鹽陽離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸鹽。

Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微生物培養(yǎng)中有0.1PPM就可以了，自來水原料中已夠用，不需另加。無機(jī)鹽種類Cncnc-micro目前二十頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

微生物生長不可缺少的微量有機(jī)物質(zhì)叫生長因子。維生素

氨基酸堿基Cncnc-micro生長因子目前二十一頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

有的微生物自己不能合成維生素，需要外加，主要是B族維生素、硫胺素、葉酸、泛酸、核黃素等，如生產(chǎn)味精需加生物素（是B族中的一種即VH）。維生素Cncnc-micro目前二十二頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

有些微生物自己不能合成某種氨基酸，必須給予補(bǔ)充，如賴AA發(fā)酵所用的黃色短桿菌不能合成環(huán)絲AA，為環(huán)絲AA缺陷型菌株，在培養(yǎng)基中必須添加含環(huán)絲AA的氮源。如豆餅水解液或毛發(fā)水解液等。氨基酸Cncnc-micro目前二十三頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

嘧啶和嘌呤是核酸和輔酶的重要組分，是許多微生物必須的生長因素。有些微生物不僅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能將補(bǔ)充的嘧啶和嘌呤結(jié)合在核苷酸上，還必須供給核苷酸，有的菌需補(bǔ)充卟啉或其衍生物，還有的菌需供給（低碳）脂肪酸等。堿基Cncnc-micro目前二十四頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)水Cncnc-micro

是細(xì)胞中生化反應(yīng)的良好介質(zhì)；營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水里，才能被吸收或排出體（細(xì)胞）外。水的比熱高，能有效的吸收代謝過程中放出的熱量，不致使細(xì)胞的溫度驟然上升。維持細(xì)胞的膨壓（控制細(xì)胞形態(tài)）。目前二十五頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)碳源、氮源、生長因子的比較來源常用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物，有些還是做異養(yǎng)生物的主要能源物質(zhì)氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分目前二十六頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細(xì)胞目前二十七頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要。合成培養(yǎng)基:目前二十八頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來源受限;成分復(fù)雜，影響對某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;天然培養(yǎng)基：目前二十九頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)（二）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后將要學(xué)到的倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中的每一步都需要做到“無菌”，即防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。目前三十頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

（１）消毒定義：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過程。2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

目前三十一頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

（2）滅菌的定義：

是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括所有細(xì)菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而達(dá)到完全無菌之過程。

滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。目前三十二頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)比較項理化因素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強(qiáng)烈全部微生物能消毒與滅菌的比較目前三十三頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精，氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法目前三十四頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)1、灼燒滅菌接種環(huán)、接種針、試管口2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：目前三十五頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計的。

目前三十六頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考目前三十七頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)3.微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存目前三十八頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)操作（一.）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）目前三十九頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟目前四十頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)8．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。目前四十一頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)倒平板技術(shù)目前四十二頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。目前四十三頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。目前四十四頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)（二）、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)目前四十五頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。目前四十六頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異目前四十七頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)霉菌的菌落特征因種而異菌落目前四十八頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)目前四十九頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。目前五十頁\總數(shù)五十九頁\編于十八點(diǎn)

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開