人類疾病易感基因鑒定大賽系列講座內容：一、生物實驗室規范與微量移液器操作 （俞建瑛副教授）二、基因組DNA的提取和酶切 （李素霞副教授）三、PCR原理與技術 （吳海珍副教授）四、基因組DNA變異的檢測 （歐陽立明副教授）人類疾病易感基因鑒定大賽

系列講座之四

基因組DNA變異的檢測Teacher:歐陽立明博士生物工程學院·應用生物學系2008.7奉賢Contentsp53基因與腫瘤個體基因組差異PCR-RFLP檢測技術本實驗整體流程4123什么是基因組？

基因組（Genome）——生物體全部的遺傳物質；原核生物的基因組真核生物的基因組：細胞核；細胞器生物體——對基因組信息復制、傳遞、解碼的復雜系統。人類基因組概況TheHumanGenomeProject(HGP)是代表性測序：24條染色體（22條常染色體+X+Y）；3×109堿基只有約3%DNA編碼蛋白質約3~4萬個基因人體基因組核型圖個體基因組差異中的秘密為什么？為什么每個人相貌、性格、智力……都不一樣？為什么有的人容易得病，有的人卻對疾病的免疫能力特別高？為什么在藥物的使用過程中，有的人一用就靈，有的人卻不靈，甚至中毒？這些現象使人們認識到：必須從不同個體基因組序列的多態性上去闡明個體對疾病和藥物反應上的多態性，才能真正了解與疾病特別是多基因疾病有關的遺傳機制，同時深入了解人類起源、進化和遷徙過程中的DNA序列變化。基因組差異的主要表現SNP(Singlenucleotidepolymorphism)：單核苷酸多態性，基因組中數量最多的分子標記SSLP(Simplesequenceslengthpolymorphism)，簡單序列長度多態性，也稱微衛星(Microsatellite)Insertionanddeletion(Indel)：堿基的插入和缺失SNP的特點就好像單詞的變體或者中文中的通假字在基因組中大量存在，已經報道了超過300萬個SNP，估計整個人類中存在1500萬個SNP一般為二等位性轉換(transition,如A→G)高于顛換(transversion,如A→T)同一位點極少發生再次復制錯誤30%位于編碼區，70%位于非編碼區同源染色體、姐妹染色單體、等位位點一對同源染色體一對姐妹染色單體A,a：一對等位位點同源染色體、姐妹染色單體、等位位點同源染色體：是指形態、結構、遺傳組成基本相同的染色體。對于同一個體來說，同源染色體對在減數第一次分裂前期中彼此聯會(配對)，并且能夠形成四分體，然后分裂到不同的生殖細胞的一對染色體，一個來自母方，另一個來自父方。姐妹染色單體：姐妹染色單體是由一個著絲點連著的并行的兩條染色單體，是在細胞分裂的間期由同一條染色體經復制后形成的。等位位點：個體或群體同源染色體上相同的位置。四分體每個四分體都有2條染色體，2對姐妹染色單體，4個DNA分子。由于四分體時期同源染色體之間經常互相纏繞，再分開時不一定能維持染色體原來的形態和組成，有可能發生同源非姐妹染色體之間的交叉互換，這是染色單體上，也是不久之后染色體上基因重組的原因。

編碼區的SNP與疾病或藥物反應個體差異關系密切，是制藥企業的金礦四種后果：同義Synonymous：

AAA(Lys)AAG(Lys)(silentmutation)無義non-sense：TGG(Trp)TGA(Stop)錯義mis-sense：AGU(Ser)ATU(Ile)。一些單基因遺傳病的病因。sicklecellanemia,hemoglobin146residue(GAG(Glu)GTG(Val)改變基因的表達SNP的演化過程如何檢測SNP或突變酶法：根據酶對DNA序列的識別特異性限制性內切酶:RFLPDNA連接酶DNA聚合酶在合成時的校正功能：TaqMan?構象分離法：電泳檢測DNA的構象變化單鏈構象多態性（SSCP）異源雙鏈電泳遷移率變化dHPLCDNA雜交法：堿基變化對DNA互補配對雜交動力學的影響DASH,DNAchip,ASO斑點雜交等直接測序法焦磷酸測序（Pyrosequencing）單堿基延伸標簽測序：(SingleBaseExtension,SBEtag)FluorescentDyeTerminator;Fluorescencepolarization;MS;MALDI-TOF基于雜交的RFLP提取基因組→酶切→特異性探針DNA雜交注意等位位點上SNP的雜合、純合在檢測結果上的差異！RFLP的特征可遺傳給子代并符合孟德爾規律?；蚪M變異的數據庫1)NCBI的遺傳變異數據庫（dbSNP）2)SNP研究聯盟（TheSNPConsortium,TSC）提供的數據庫：3)人類基因組突變數據庫（theHumanGenomeVariation,HGVbase）

p53基因與腫瘤p53是一個抑癌基因，可誘導異常細胞進入凋亡。幾乎所有的腫瘤和約50%的惡性腫瘤中都發現了p53基因的突變或缺失。突變的結果是90%導致翻譯出的氨基酸發生改變，10%是不能形成P53蛋白。

Moredetailspleasereferto:P53蛋白的結構轉錄激活區脯氨酸富含區，與DNA損傷介導的細胞凋亡有關核心結構區(DNA結合區)，突變高發區，引起蛋白質構象變化。核定位信號（NLS），高度保守p53的突變位點統計人類腫瘤p53基因突變腫瘤類型突變頻率（％）突變熱點（密碼子）肺癌56157，248，273結腸癌50175，245，248，273卵巢癌44273胰腺癌44273皮膚癌44248,278胃癌41不確定頭頸部鱗癌37248膀胱癌24280前列腺癌30不確定肝細胞癌45249膠質瘤25175,248乳腺癌22175，248，273子宮內膜癌22248甲狀腺癌13248，273白血病12175，248

食管癌45不確定PCR擴增區域圖解Codon248cCGG(Arg)→cTGG(Trp)cCTG(Leu)cCAG(Gln)↓MspI248位密碼子的突變類型預期電泳結果正常PCRGenome100bp200bp300bp500bpDNAMarkerFig.1PCR-RFLPresultofp53geneM1:Marker3(200,500,800…)bp;1:GenomeDNA2:PCRresultofexon7fragmentofp53geneM2:100bpladderDNAMarker3:Digestionresult200bp500bp800bpM112M23大賽實驗流程（PCR-RFLP）1)個體基因組提取2)PCR獲得p53基因第7外顯子片段3)對PC