生物色譜技術(shù)第1頁/共33頁因為有同學(xué)沒有學(xué)習(xí)過色譜，我們大概介紹一下色譜技術(shù)的起源。色譜技術(shù)最初就是俄國的植物學(xué)家茨維特發(fā)明的。1906年，茨維特在研究植物色素的過程中，做了一個經(jīng)典的實驗：在一根玻璃管的狹小一端塞上一小團(tuán)棉花，在管中填充沉淀碳酸鈣，這就形成了一個吸附柱。然后將其與吸濾瓶連接，使綠色植物葉子的石油醚抽取液自柱中通過。結(jié)果植物葉子中的幾種色素便在玻璃柱上展開：留在最上面的是兩種葉綠素；綠色層下面接著葉黃素；隨著溶劑跑到吸附層最下層的是黃色的胡蘿卜素。這樣吸附柱成了一個有規(guī)則的與光譜相似的色層。然后把該潮濕的吸附柱從玻璃管中推出，依色層的位置用小刀切開，于是各種色素就得以分離。再用醇為溶劑將色素溶解出來，即得到了各成分的純?nèi)芤海纱藢崿F(xiàn)了色素的分離和制備。1903年，他將這一研究成果發(fā)表在華沙的《生物學(xué)雜志》上，這就是有關(guān)色譜法的第一篇研究論文。但當(dāng)時他用俄文寫的報告未能引起人們的興趣，一直到他死后威爾施塔特重新介紹了這種方法時，他的工作才受到了人們的注意。第2頁/共33頁色譜法31903–MikhailTswettdefinestheScienceofChromatography

ChromatographyInventorM.S.Tswett(茨維特)第3頁/共33頁生物色譜法生物色譜法（Biochromatography）是20世紀(jì)80年代中后期問世，由生命科學(xué)與色譜分離技術(shù)交叉形成的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d色譜技術(shù)。細(xì)胞膜色譜法親和色譜法常規(guī)色譜法固定相含有生物大分子固定相和研究對象都是生物大分子研究對象是生物大分子4第4頁/共33頁細(xì)胞膜色譜CellMembraneChromatography,CMC將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相，利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動力學(xué)新方法。特點(diǎn)：分離+活性篩選合二為一適合于天然藥物活性成分的篩選及藥物作用機(jī)理的研究。5第5頁/共33頁舉例α1A腎上腺素受體高表達(dá)細(xì)胞膜色譜

a：酚妥拉明b：5-羥色胺c：甲氧明d：羥甲唑啉6abcd第6頁/共33頁親和色譜AffinityChromatography，AC

利用生物大分子具有對某一類生物大分子特異性識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。親和識別：

抗體-抗原

酶-底物

激素-受體載體配體7第7頁/共33頁IgG蛋白8第8頁/共33頁親和色譜分離原理2.配體與目標(biāo)物吸附；3.洗脫目標(biāo)物；1.找與底物專一可逆結(jié)合的配體,將配體通過共價鍵偶聯(lián)到載體。94.親和柱再平衡。第9頁/共33頁親和體系特異性親和體系高特異性抗原－抗體荷爾蒙－受體蛋白核酸－互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白酶－底物、產(chǎn)物、抑制劑群特異性免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白酶－輔酶凝集素－糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體酶、蛋白質(zhì)－肝素酶、蛋白質(zhì)－活性色素（染料）酶、蛋白質(zhì)－過渡金屬離子（銅、鋅等）酶、蛋白質(zhì)－氨基酸（組氨酸等）10第10頁/共33頁核酸結(jié)合蛋白11第11頁/共33頁A蛋白12從A型金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分離而得的一種細(xì)胞壁蛋白。可與人類大多數(shù)類型的IgG(IgG3除外)的Fc段結(jié)合，但很少或幾乎不與人類的IgM結(jié)合。用于免疫分析和IgG的提純。葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalproteinA,SPA)免疫球蛋白

A（immunoglobulinA，IgA）已有研究證明，呼吸道分泌液中SigA含量的高低直接影響呼吸道粘膜對病原體的抵抗力，兩者呈正相關(guān)。1.與病毒或細(xì)菌毒素結(jié)合，從而阻止它們進(jìn)入或破壞細(xì)胞；2.附著在細(xì)菌的鞭毛上，讓其活動性減弱，并且更容易被巨噬細(xì)

胞吞噬.第12頁/共33頁親和色譜純化抗體原理13第13頁/共33頁親和色譜分離示意圖14第14頁/共33頁親和色譜的固定相無機(jī)氧化物：SiO2、Al2O3、ZrO3生物聚合物：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖、葡聚糖等。

配體載體間隔臂固定相1.載體（support，又稱基體matrix）①親水但不溶于水，可溶脹；②大孔且有一定的機(jī)械強(qiáng)度；③化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且易于改性；④表面積很大但呈現(xiàn)惰性；特性15第15頁/共33頁專一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度相互作用的強(qiáng)弱決定著吸附和解吸的難易程度特異性配體生物素－親和素、抗原－抗體、酶－抑制劑、激素－受體通用性配體凝集素－各種糖蛋白，核酸－RNA、RNA－蛋白質(zhì)2.配位體（ligand，又稱底物substrate）親和色譜的固定相16第16頁/共33頁親和色譜的固定相①脂肪族有機(jī)物或多肽、蛋白組成；②具有雙官能團(tuán)，一端連接載體，一端偶聯(lián)配體；③長度直接影響固定相的立體效應(yīng)；④可在對載體進(jìn)行化學(xué)改性的時候形成；⑤可具有疏水性或親水性。3.間隔臂（spacer或spacerarms）小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。17第17頁/共33頁親和色譜的洗脫方式18階梯式梯度線性梯度第18頁/共33頁影響洗脫過程的因素1.離子強(qiáng)度：提高離子強(qiáng)度，親和作用減弱或完全破壞。2.pH值：在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，

親和作用減弱或完全破壞。3.離液劑：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用。4.溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；

疏水性相互作用增強(qiáng)。5.液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱。6.螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失19第19頁/共33頁中壓液相色譜儀北京東西分析儀器有限公司LC-5600系列常（中）壓生化制備液相色譜儀20GE公司第20頁/共33頁舉例21第21頁/共33頁常規(guī)色譜親和柱22第22頁/共33頁反相色譜法水+乙腈23第23頁/共33頁反相色譜分離多肽24第24頁/共33頁反相色譜分離多肽重現(xiàn)性重現(xiàn)性好！25第25頁/共33頁反相色譜分離蛋白26第26頁/共33頁體積排阻色譜分子量大的先被洗脫出來，分子量小的后被洗脫出來。原理：是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法，體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。27第27頁/共33頁28體積排阻色譜第28頁/共33頁離子交換色譜原理：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差

異來實現(xiàn)分離。29陽離子交換樹脂

大都含有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)或苯酚基(-C6H4OH)等酸性基團(tuán)，其中的氫離子能與溶液中的金屬離子或其他陽離子進(jìn)行交換。2R-SO3H+Ca2+----(R-SO3)2Ca+2H+硬水軟化原理第29頁/共33頁離子交換色譜30陰離子交換樹脂大都含有季胺基[-N(CH3)3OH]、胺基(-NH2)或亞胺基(-NH2)等堿性基團(tuán)。它們在水中能生成OH-離子，可與各種陰離子起交換作用。R-N(CH3)

3OH+Cl-----RN