霍亂弧菌實驗室檢測技術北京市海淀區疾病預防控制中心霍亂的流行情況霍亂的生物學性狀樣本的采集檢驗操作程序熒光定量PCR方法檢測O1群、O139群霍亂弧菌及霍亂毒素提綱由O1群、O139群霍亂弧菌引起的霍亂以發病急、傳播快、波及范圍廣、能引起大流行為特征，被世界衛生組織列為國境衛生檢疫傳染病，也是我國傳染病防治法中規定強制管理的甲類傳染病。O139群霍亂弧菌的流行情況1992年印度馬德拉斯發生O139霍亂并迅速傳播1993年6月我國新疆發現O139霍亂流行。1994年我市發現O139霍亂疫情O1群和O139群霍亂弧菌與其他霍亂弧菌的最大區別是能產生相同的霍亂毒素弧菌的分類形態與染色抗原結構、血清群生長與培養特性生化反應特性對外界的抵抗力藥物敏感性霍亂的生物學性狀弧菌的分類（包括5個屬）弧菌屬霍亂弧菌、副溶血弧菌、擬態弧菌、河弧菌等等氣單胞菌屬鄰單胞菌屬發光菌屬水棲菌屬霍亂的生物學性狀形態與染色革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓或稍平單鞭毛、魚群樣排列，菌體彎曲呈弧形或逗點狀暗視野顯微鏡下，霍亂弧菌運動活潑，呈穿梭狀或流星狀培養基上菌落略帶灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑濕潤霍亂的生物學性狀單鞭毛、魚群樣排列，菌體彎曲成弧形或逗點狀

生長與培養特性好氧同時兼性厭氧，最適生長溫度37℃鈉離子可刺激生長耐堿不耐酸初次分離時常用堿性蛋白胨水(pH8.8-9.0)增菌培養，霍亂弧菌經6～8h增菌后可在液體表面大量繁殖，形成菌膜霍亂的生物學性狀

生化反應特性兩個生物型的霍亂弧菌都能分解甘露醇、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖產酸不產氣遲緩發酵乳糖，不分解阿拉伯糖氧化酶試驗弧菌屬細菌大多為陽性粘絲實驗弧菌屬細菌大多為陽性霍亂的生物學性狀霍亂的致病性主要毒素霍亂腸毒素CT小帶聯結毒素zot輔助霍亂腸毒素ace溶血素、溶細胞素、志賀樣毒素O139群除具有上述O1群的致病物質外，還存在莢膜多糖和特殊LPS毒性決定簇，可抵抗血清中殺菌物質和黏附到小腸黏膜上。

霍亂的生物學性狀

腹瀉患者樣本采集水樣便采1~3ml，成形便取指甲大小量肛拭子：生理鹽水浸濕采便管由肛門插入直腸內3~5cm處旋轉取出嘔吐物采1~3ml標本和堿胨水比例為1：5水樣及液體標本采集采集相對靜止表層水（30cm內）500ml其他液體標本采集500ml2~3小時內送檢涂抹樣本采集2~3支無菌棉簽涂抹3~5只以上水生動物表面、腮部及泄殖腔2~3支無菌棉簽涂抹食品或物品表面（地溝口，下水管口，水池壁涂抹，餐盤內外側）直接放入10ml堿胨水送檢樣本的采集典型的米泔水樣便

增菌及分離培養堿性蛋白胨水pH8.8-9.0注意標本和胨水的比例要適當分離培養基分兩類選擇性強的培養基四號瓊脂、TCBS、慶大培養基選擇性弱的培養基堿性瓊脂和堿性膽鹽瓊脂檢驗操作程序霍亂弧菌在慶大培養基上菌落形態。(菌落呈現無色、圓形半透明、濕潤、扁平或稍突起、邊緣整齊，由于亞碲酸鉀的作用，菌落中央常呈灰色或灰黑色）Ｏ１３９型霍亂弧菌在４號平板和ＴＣＢＳ上的菌落形態

菌株的初步鑒定血清凝集試驗復核及鑒定血清凝集試驗革蘭氏染色氧化酶試驗粘絲試驗動力試驗檢驗操作程序

菌株的初步鑒定血清凝集試驗挑取可疑菌落與O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗，很快出現均勻沙粒樣凝集顆粒為陽性（一般不超過10s）注意：菌液渾濁，似凝非凝不能判定為陽性同時做生理鹽水對照在1min內不出現凝集為陰性結果可疑時需要做PCR鑒定檢驗操作程序

菌株的復核及分型粘絲試驗弧菌屬大部分為陽性作為弧菌的簡易輔助鑒定方法在玻璃平皿上滴一大滴0.5%去氧膽酸鈉溶液取營養瓊脂上新鮮培養物研磨后與試劑研磨混合混懸液變清亮粘稠，可拉出細長絲者為陽性陰性者呈均勻懸液狀態動力試驗革蘭氏染色檢驗操作程序

藥敏試驗根據美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）推薦的Kirby-Bauer（K-B）氏法進行。檢驗操作程序菌種接種營養瓊脂37℃16～18h

菌落接種營養肉湯37℃4～6h

調整菌液到0.5麥氏單位MH培養基上涂布菌液貼藥敏紙片游標卡尺測量抑菌圈直徑

37℃18～24h

藥敏試驗注意事項每次藥敏試驗必須用ATCC25922大腸桿菌做質控使用的MH培養基不能太薄使用的MH培養基PH值應為7.3抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限

不可用過期的試劑和藥敏紙片檢驗操作程序

熒光定量PCR方法鑒定探針和引物檢驗操作程序SO1FGACTCACCTTCGATTTCAGCAASO1RGAATAACTCAAGGCGATGAAGTGATO1probeFACGGGTAACGCACCACACTGGACTATGPSO139FGCGGTGTAGCGGGTTTTATTAGSO139RTGCATAATACTTTCGACCATGGAO139probeFAAACAGTCGACCGGCGATAAACGCTPSCTXFTTTCATCGCAAGTATTACTCATCGASCTXRAAGAGCCGTGGATTCATCATGCTprobeFAGCATTCCCACAACCCGGCGP

熒光定量PCR方法鑒定模板的制備：挑取數個菌落加入裝有100μＬ去離子水的1.5mL管中,混勻后100℃10分鐘，12000轉/分鐘離心5分鐘，取上清液作為模板。檢驗操作程序

熒光定量PCR方法鑒定反應體系的配制(20μＬ體系)

（PemixExTaqTM

TaKaRa

生物公司提供）

2×PCR反應混合物：10μＬ/份上游引物（10μM）：0.4μＬ/份下游引物（10μM）：0.4μＬ/份

探針（10μmol/Ｌ）：0.4μＬ/份

模板DNA：2μＬ/份

DDw：6.8μＬ/份

Total: