第三章蛋白質(zhì)B第1頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次一級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域

supersecondarystructureStructuredomain二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)第2頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

多肽鏈中氨基酸的連接方式和排列順序，包括二硫鍵的位置稱為蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(primarystructure)。這是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)，它內(nèi)寓著決定蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物功能的信息。例：牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)第3頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（一）

肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽：一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。肽鍵：氨基酸間脫水后形成的共價(jià)鍵稱肽鍵（酰氨鍵），肽單位：酰胺平面，肽單位間以α-C原子相隔，構(gòu)成肽鏈第4頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一5肽

名稱：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸寫(xiě)法：ＮSer-Gly--Try-AlaLeuC（或ＳＧＹＡＬ）第5頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一對(duì)于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從N端直接測(cè)至C端，但目前只能測(cè)60個(gè)N端氨基酸。

兩種以上特異性裂解法

NCA法裂解

A1

A2

A3

A4

B法裂解

B1

B2

B3

B4

（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

1.直接法第6頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一基本戰(zhàn)略：片段重疊法＋氨基酸順序直測(cè)法要點(diǎn)：a.測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量及其氨基酸組分

b.測(cè)定肽鍵的N－末端和C－末端

c.應(yīng)用兩種或兩種以上的肽鍵內(nèi)切酶分別在多肽鍵的專一位點(diǎn)上斷裂肽鍵；也可用溴化氰法專一性地?cái)嗔鸭琢虬彼嵛稽c(diǎn)，從而得到一系列大小不等的肽段。

d.分離提純所產(chǎn)生的肽段，并分別測(cè)定它們的氨基酸順序

e.將這些肽段的順序進(jìn)行跨切口重疊，進(jìn)行比較分析，推斷出蛋白質(zhì)分子的全部氨基酸序列。第7頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

①

化學(xué)裂解法

溴化氰—Met—X—

產(chǎn)率85%

●

肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化第8頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一②

酶法裂解★

胰蛋白酶Lys——X(X≠Pro)Arg——X

★

胰凝乳蛋白酶Tyr——X(X≠Pro)Trp——X

Phe——X★

胃蛋白酶

Phe(Trp、Try、Leu)——Phe(Trp、Try、Leu)第9頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一③

肽段的分離純化★電泳法ＳＤＳ－ＰＡＧＥ根據(jù)分子量大小分離★離子交換層析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根據(jù)肽段的電荷特性分離★反相ＨＰＬＣ法根據(jù)肽段的極性分離★凝膠過(guò)濾要求：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ單帶ＨＰＬＣ單峰Ｎ端單一（常用ＤＮＳ－Cl法）第10頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一●

肽段序列測(cè)定及肽鏈的拼接

Edman法A耦聯(lián)

PITC＋H２N—A-B-C-DpH8—9，40℃PTC——A-B-C-DB裂解無(wú)水三氟乙酸（TFA）

ATZ—A+H2N—B-C-DC轉(zhuǎn)化PTH—A

PTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸）

第11頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.

間接法（測(cè)核酸序列推斷氨基酸序列）第12頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

樣品在質(zhì)譜儀的離子源中通過(guò)一定的方式發(fā)生電離，形成帶電的分子或分子碎片，再借助電場(chǎng)或磁場(chǎng)的作用使這些離子依質(zhì)荷比（m/z）的不同獲得分離，并按質(zhì)荷比大小為序沖擊檢測(cè)器，從而得到質(zhì)譜圖，對(duì)樣品進(jìn)行鑒定。3.質(zhì)譜法（Massspectrometry-MS）

第13頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1886年發(fā)明質(zhì)譜儀的離子源，1942年第一臺(tái)商品化質(zhì)譜儀問(wèn)世，分析對(duì)象主要是小分子。20世紀(jì)80年代電離質(zhì)譜技術(shù)-電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）兩項(xiàng)技術(shù)使質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命的變革，質(zhì)譜技術(shù)真正走入了生命科學(xué)的研究領(lǐng)域。第14頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

m/zAcquiredMSspectrumMSanalysisofPeptidefingerprintingDatabaseSearchProteinID1.通過(guò)MS/MS分析確認(rèn)2.搜索到的蛋白質(zhì)分子量是否與膠上的一致?3.這個(gè)蛋白質(zhì)是不是來(lái)自于你所期望的生物種？這個(gè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）與你膠上相應(yīng)的等電點(diǎn)是否一致？In-geldigestionWithtrypsinStepsinproteinidentificationbymassspectrometry第15頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一In-geldigestionwithtrypsinPeptidesSpecificProteinspotProteininDatabasePredictedpeptidesFromhypotheticalTrypsintreatmentPredictedMSspectrumAcquiredMSspectrumTheproteinisexcisedfromagel,in-geltrypticdigestion,and peptidefingerprintingisthenidentifiedbyMassspectrometer(B)TheMSSpectrumisthensearchedagainsttheoreticalmassspectraproducedby computer-generatedcleavageofproteinsinthedatabase第16頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一ProteinseparationOngelelectrophoresisSpecificproteinIn-geldigestionIsexcisedwithtrypsinMALDI-TOFanalysisProteinIdentificationbyMS/MSProteinPeptidesMSpeptidespectrum678.8678.8679.3

SelectedParentIonMS/MSDatabaseSearchSpecificproteinidentified第17頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一氨基保護(hù)：叔丁氧甲酰氯（BOC-Cl）、芐氧酰氯（CBZ-Cl）、對(duì)甲苯磺酰氯Tosyl-Cl）。羧基保護(hù)：芐酯、叔丁酯（成鹽、成酯）羧基活化：酰氯法（PCL5）、疊氮法、混合酸酐法、活化酯法。縮合劑：DCCI（二環(huán)己基碳二亞胺）直接接肽（三）多肽與蛋白質(zhì)的人工合成第18頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondarystructure）指肽鏈主鏈不同區(qū)段通過(guò)自身的相互作用，形成氫鍵，沿某一主軸盤(pán)旋折疊而形成的局部空間結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象單元．第19頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（一）相鄰肽鍵的空間結(jié)構(gòu)

肽單位與α-碳原子的二面角肽平面第20頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一★肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）酰胺氮上的孤對(duì)電子與相鄰羰基之間形成共振雜化體。（2）肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。（3）肽鍵具有平面性，組成肽鍵的4個(gè)原子和2個(gè)Cα幾乎處在同一平面內(nèi)（酰氨平面）。（4）肽鍵亞氨基在pH014內(nèi)不解離。（5）肽鏈中的肽鍵一般是反式構(gòu)型，而Pro的肽鍵可能出現(xiàn)順、反兩種構(gòu)型．第21頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一酰胺平面與α-碳原子的二面角（φ和ψ

）

二面角

兩相鄰酰胺平面之間，能以共同的Cα為定點(diǎn)而旋轉(zhuǎn)，繞Cα-N鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱φ角，繞C-Cα鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱ψ角。φ和ψ稱作二面角，亦稱構(gòu)象角。第22頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

肽鏈的二面角★只有α碳原子連接的兩個(gè)鍵（Cα—N和Cα-C）是單鍵，能自由旋轉(zhuǎn)。

★環(huán)繞Cα—N鍵旋轉(zhuǎn)的角度為Φ環(huán)繞Cα—C鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱Ψ第23頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一完全伸展的多肽主鏈構(gòu)象α-碳原子酰胺平面Φ=00，ψ=00的多肽主鏈構(gòu)象酰胺平面Φ=00，ψ=00側(cè)鏈非鍵合原子接觸半徑第24頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一可允許的Φ和Ψ值Φ和Ψ同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在二面角（Φ、Ψ）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無(wú)阻礙。Cα上的R基的大小與帶電性影響Φ和Ψ第25頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型第26頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）

α螺旋的一般特征：★多肽主鏈按右手或左手方向盤(pán)繞，形成右手螺旋或左手螺旋，★相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵★構(gòu)成螺旋的每個(gè)Cα都取相同的二面角

Φ、Ψ。1α－螺旋（α－h(huán)elix）第27頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第28頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一典型的α螺旋有如下特征：①二面角：Φ=-57°,Ψ=-48°，是一種右手螺旋②每圈螺旋：3.6個(gè)a.a殘基，高度：0.54nm③每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，沿軸上升0.15nm④氨基酸殘基側(cè)鏈向外⑤相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。⑥肽鍵上C=O氧與它后面（C端）第四個(gè)殘基上的N-H

氫間形成氫鍵。第29頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）

R側(cè)鏈對(duì)α—螺旋的影響①多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸殘基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成穩(wěn)定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。②Gly在肽中連續(xù)存在時(shí)，不易形成α—螺旋。③R基大（如Ile）不易形成α—螺旋④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。⑤R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α—螺旋。第30頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2

β－折疊（β-pleatedsheet）

兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈（或同一肽鏈的不同肽段）側(cè)向聚集在一起，相鄰肽鏈主鏈上的NH和C=0之間形成氫鏈，這樣的多肽構(gòu)象就是β-折疊片。（1）氫鍵與肽鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。（2）多肽主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象（3）側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。平行式：所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向。反平行式：肽鏈的極性一順一倒，N端間隔相同反平行β-折疊比平行的更穩(wěn)定第31頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第32頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第33頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3β-轉(zhuǎn)角（β-turn）也稱β-回折（reverseturn）、β-彎曲（β-bend）球狀蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的180°回折，由第一個(gè)aa殘基的C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的N-H間形成氫鍵。

β轉(zhuǎn)角的特征：①由多肽鏈上4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成。②主鏈骨架以180°返回折疊。③第一個(gè)a.a殘基的C=O與第四個(gè)a.a殘基的N-H生成氫鍵④C1α與C4α之間距離小于0.7nm⑤多數(shù)由親水氨基酸殘基組成。第34頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一4無(wú)規(guī)則卷曲（nonregularcoil）無(wú)規(guī)則卷曲示意圖第35頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（三）蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)中相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單位（即單個(gè)α－螺旋或β－折疊或β－轉(zhuǎn)角）組合在一起，形成有規(guī)則的、在空間上能辯認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體稱為蛋白質(zhì)的超二級(jí)結(jié)構(gòu)

基本組合方式：αα；β×β；βββ

超二級(jí)結(jié)構(gòu)（supersecondarystructure）第36頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一超二級(jí)結(jié)構(gòu)類型βββααβ×ββαβ回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)β-迂回第37頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（四）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域

結(jié)構(gòu)域

domain，motif(模塊)

在二級(jí)結(jié)構(gòu)及超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步卷曲折疊，組裝成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的、近似球形的三維實(shí)體。第38頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位較小的蛋白質(zhì)分子或亞基往往是單結(jié)構(gòu)域的。結(jié)構(gòu)域一般有１００－２００氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連，形成所謂的鉸鏈區(qū)，使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)。結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。例如，脫氫酶類的多肽主鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)為NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是起催化作用的結(jié)構(gòu)域，兩者組合成脫氫酶的脫氫功能區(qū)。結(jié)構(gòu)域間的裂縫，常是酶的活性部位，也是反應(yīng)物的出入口第39頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)●整個(gè)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤(pán)旋、折疊，形成的特定的整個(gè)空間結(jié)構(gòu)。●三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈中所有原子的空間排布。第40頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

三級(jí)結(jié)構(gòu)有以下特點(diǎn)：許多在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的aa在三級(jí)結(jié)構(gòu)上相距很近。球形蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很密實(shí)，大部分的水分子從球形蛋白的核心中被排出，這使得極性基團(tuán)間以及非極性基團(tuán)間的相互作用成為可能。大的球形蛋白(200aa以上)，常常含有幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，第41頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：（1）氫鍵（2）范德華力（分子間及基團(tuán)間作用力）：極性基團(tuán)間極性與非極性基團(tuán)間非極性基團(tuán)間（3）疏水相互作用（4）離子鍵（鹽鍵）（5）共價(jià)健，主要的是二硫鍵，二硫鍵不指導(dǎo)多肽鏈的折疊，三級(jí)結(jié)構(gòu)形成后，二硫鍵可穩(wěn)定此構(gòu)象。第42頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力

a.鹽鍵b.氫鍵c.疏水鍵d.范得華力e.二硫鍵多肽鏈第43頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一肌紅蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)第44頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一卵溶菌酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域-螺旋-轉(zhuǎn)角-折疊二硫鍵結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域2第45頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一核糖核酸酶三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

N

His12CHis119Lys41第46頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)

四級(jí)結(jié)構(gòu)是指由相同或不同的稱作亞基（subunit）的亞單位按照一定排布方式聚合而成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，維持四級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力是疏水鍵、離子鍵、氫鍵、范得華力。亞基本身都具有球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)，一般只包含一條多肽鏈，也有的由二條或二條以上由二硫鍵連接的肽鏈組成。

第47頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（一）纖維狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

含大量的α-螺旋，β-折疊片，整個(gè)分子呈纖維狀廣泛分布于脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，起支架和保護(hù)作用。五纖維狀蛋白和球狀蛋白的結(jié)構(gòu)第48頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1角蛋白

源于外胚層細(xì)胞，包括皮膚及皮膚的衍生物（發(fā)、毛、鱗、羽、甲、蹄、角、爪、絲）。

α-角蛋白，β角蛋白

第49頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（1）

α-角蛋白（毛發(fā)）主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成三股右手α-螺旋向左纏繞形成原纖維，原纖維排列成“9+2”的電纜式結(jié)構(gòu)稱微纖維，成百根微纖維結(jié)合成大纖微。

第50頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第51頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第52頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第53頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（2）

β-角蛋白（絲心蛋白）以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。片層結(jié)構(gòu)：反平行式β-折疊片以平行的方式堆積。鏈間主要以氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。第54頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一（二）球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)特征1）含有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件2）具有明顯的折疊層次3）分子呈現(xiàn)球狀或橢球狀4）疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，親水側(cè)鏈暴露在外表5）表面常常有空穴，配體結(jié)合部位（活性中心）第55頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)一蛋白質(zhì)分子的大小和形狀二、兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)三、蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀五、蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性六、蛋白質(zhì)的紫外吸收特性七、蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)八蛋白質(zhì)的水解第56頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一一蛋白質(zhì)分子的大小和形狀測(cè)分子量的方法：★化學(xué)組成法測(cè)定最低分子量★SDS法★凝膠過(guò)濾法★滲透壓法★擴(kuò)散系數(shù)法★沉降系數(shù)法和沉降平衡法第57頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

SDS—PAGE（十二烷基硫酸鈉——

聚丙烯酰胺凝膠電泳）第58頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二兩性解離性質(zhì)及等電點(diǎn)pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)PrCOOHNH3++H++

OH-+H++

OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液在某一定pH值時(shí)，使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）。第59頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一三蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能通過(guò)半透膜）。

穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素

①蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜

②非等電狀態(tài)時(shí)，同種電荷的互相排斥。

③質(zhì)點(diǎn)大小在1-100nm，可以進(jìn)行布郎運(yùn)動(dòng)第60頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一四蛋白質(zhì)的沉淀

如果加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層（消除相同電荷，除去水膜），蛋白質(zhì)膠體溶液就不再穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。

第61頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

選擇性沉淀蛋白質(zhì)的方法

①鹽析法:

大量的中性鹽[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。②有機(jī)溶劑沉淀法：破壞水化膜，降低介電常數(shù)，PEG、丙酮、乙醇等③重金屬鹽沉淀：pH＞pI時(shí)帶負(fù)電荷，與重金屬離子（Hg2+.Pb2+.Cu2+

等）結(jié)成不溶性沉淀④生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pH小于等電時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：?jiǎn)螌幩帷⒖辔端帷㈡u酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸。⑤加熱變性沉淀。⑥等電點(diǎn)沉淀法第62頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一五蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性

●蛋白質(zhì)各自所特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)，是表現(xiàn)其物理性質(zhì)和化學(xué)特性以及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。當(dāng)天然蛋白質(zhì)受到某些物理因素和化學(xué)因素的影響，使其分子內(nèi)部原有的高級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致其一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象稱為變性作用（denaturation）。

表征：生物活性喪失；物理性質(zhì)（溶解度、粘度、擴(kuò)散系數(shù)、光譜特性等）和化學(xué)性質(zhì)（化學(xué)反應(yīng)，被酶解性）改變

應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……

●蛋白質(zhì)的變性作用如果不過(guò)于劇烈，則是一種可逆過(guò)程，變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊成原來(lái)的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象成為復(fù)性（renaturation）。第63頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一變性的因素：強(qiáng)酸和強(qiáng)堿；有機(jī)溶劑：破壞疏水作用；去污劑：去污劑都是兩親分子，破壞疏水作用；還原性試劑：尿素、-硫基乙醇；鹽濃度：鹽析、鹽溶；重金屬離子：Hg2+、pb2+，能與-SH或帶電基團(tuán)反應(yīng)。溫度；機(jī)械力：如攪拌和研磨中的氣泡。第64頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一蛋白質(zhì)變性后，往往出現(xiàn)下列現(xiàn)象：①生物活性喪失②硫水基團(tuán)外露，分子結(jié)構(gòu)伸展松散，易被蛋白酶水解。③溶解度降低、沉淀，粘度增加。變性的實(shí)質(zhì)：次級(jí)鍵（有時(shí)包括二硫鍵）被破壞，天然構(gòu)象解體。變性不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞可逆變性與不可逆變性★制備活性蛋白質(zhì)時(shí)嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。第65頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一六蛋白質(zhì)的紫外吸收特性

蛋白質(zhì)在遠(yuǎn)紫外光區(qū)（200-230nm）有較大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用這一特性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定量鑒定。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260測(cè)定范圍：0.1～0.5mg/ml第66頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一七蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)酚試劑反應(yīng)→蛋白質(zhì)定量、定性

茚三酮反應(yīng)測(cè)定常用方法

第67頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一雙縮脲反應(yīng)

蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與硫酸銅發(fā)生相同反應(yīng)，產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物紅紫色絡(luò)合物(鹼性溶液)Cu2+第68頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第五節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能

蛋白質(zhì)復(fù)雜的組成和結(jié)構(gòu)是其多種多樣生物學(xué)功能的基礎(chǔ)；而蛋白質(zhì)獨(dú)特的性質(zhì)和功能則是其結(jié)構(gòu)的反映。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)包含了其分子的所有信息，并決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，高級(jí)結(jié)構(gòu)和其功能密切相關(guān)。

第69頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

一蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和功能

1蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與同源性同源蛋白質(zhì)：在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。如：血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能，細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。第70頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)：①同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）②有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來(lái)說(shuō)都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。③多肽鏈長(zhǎng)度相同或相近第71頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一通過(guò)比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。第72頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(1)

細(xì)胞色素C

分子量：12500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩0人與猴1人與狗10人與酵母44第73頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一不同生物來(lái)源的細(xì)胞色素c中不變的AA殘基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素細(xì)胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基

35個(gè)不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識(shí)別”并結(jié)合細(xì)胞色素還原酶和氧化酶。第74頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目生物與人不同的AA數(shù)目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、豬、羊、狗11馬12雞、火雞13響尾蛇14海龜15金槍魚(yú)21角餃23小蠅25蛾31小麥35粗早鏈孢霉43酵母44

第75頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一(2)胰島素●有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：A．B鏈上6個(gè)Cys不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。●其它可變氨基酸對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反應(yīng)起作用。●豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。第76頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病分子病：基因突變引起的某個(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa殘基由正常的Glu變成了疏水性的Val

正常人血紅蛋白，β.NGlu6鐮刀型貧血β.NVal6生理?xiàng)l件下電荷：

Glu-Va10

親水

疏水

第77頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一-鏈N端氨基酸排列順序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…第78頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，功能喪失

實(shí)例：核糖核酸酶的變性與復(fù)性蛋白質(zhì)在表現(xiàn)生物功能時(shí)，構(gòu)象發(fā)生一定變化（變構(gòu)效應(yīng)）

實(shí)例：血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)和輸氧功能第79頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1.核糖核酸酶變性與復(fù)性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis變性復(fù)性第80頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2.肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能：

肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧的蛋白質(zhì)。由一條多肽鏈（珠蛋白）和一個(gè)血紅素輔基組成。球狀分子，單結(jié)構(gòu)域。

8段直的α-螺旋組成，分別命名為A、B、C…H，拐彎處是由1~8個(gè)氨基酸組成的松散肽段（無(wú)規(guī)卷曲）。4個(gè)Pro殘基各自處在一個(gè)拐彎處，另外4個(gè)是Ser、Thr、Asn、Ile。

血紅素輔基，扁平狀，結(jié)合在肌紅蛋白表面的一個(gè)洞穴內(nèi)。

第81頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第82頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第83頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

▲

接近于球體，4個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。▲

α、β鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似，

3.血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)O2第84頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第85頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

波耳效應(yīng)及其生理意義血紅蛋白上有CO2結(jié)合部位，因此，血紅蛋白還能運(yùn)輸CO2

。波耳效應(yīng)：增加CO2的濃度、降低pH能顯著提高血紅蛋白亞基間的協(xié)同效應(yīng)，降低血紅蛋白對(duì)O2的親和力，促進(jìn)O2的釋放，反之，高濃度的O2也能促使血紅蛋白釋放H+和CO2

。

第86頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一第六節(jié)蛋白質(zhì)的分離，純化和鑒定

一蛋白質(zhì)分離純化的一般原則

純化的實(shí)質(zhì)：增加制品(preparation)的純度或比活性一般程序：前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)、濃縮與保存第87頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一

電泳

前處理粗分離細(xì)分離生物組織

無(wú)細(xì)胞提取液破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質(zhì)凝膠過(guò)濾疏水層析吸附層析第88頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一1前處理：①將組織和細(xì)胞破碎動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)（waringblender)

勻漿器（homogenizer)

超聲波處理（ultrasonication)植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨纖維素酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）②

差速離心法收集細(xì)胞的某一組分③如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。第89頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一2粗分級(jí)（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。①（NH4）2SO4分級(jí)沉淀法（鹽析）②等電點(diǎn)選擇性沉淀法③有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法④熱處理選擇性沉淀法⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法第90頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一3細(xì)分級(jí)（finefractionation)①透析除鹽②sephdexG-25凝膠過(guò)濾除鹽★層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）★電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤(pán)狀電泳、等電聚焦、雙向電泳★密度梯度離心第91頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一濃縮與保存濃縮方法：保存方法：①晶體保存：結(jié)晶過(guò)程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。②凍干粉保存：③溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20~-70℃保存。第92頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一二

分離純化蛋白質(zhì)的主要方法★

根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度分離★根據(jù)電荷差異分離★根據(jù)分子大小分離★根據(jù)配體特性異性分離（親和層析）★選擇性吸附分離（物理吸附）★根據(jù)疏水性的差異

第93頁(yè)，共116頁(yè)，2023年，2月20日，星期一半透膜阻留pr分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過(guò)，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。1