放射免疫分析課件第1頁/共113頁放射免疫分析第2頁/共113頁第1講放射免疫分析

的概念和產(chǎn)生放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是最早的一種標記免疫分析，通過放射性示蹤物觀察抗原與抗體的結(jié)合反應產(chǎn)物測定微量物質(zhì)。第3頁/共113頁1952年I.A.Mirsky提出老年性糖尿病可能不是因為胰島素分泌不足引起的，而是由于肝胰島素酶降解胰島素的速度加快引起的。第4頁/共113頁為了驗證這種觀點，S.A.Berson和R.S.Yalow等人(1956)給非糖尿病和糖尿病受試者靜脈注射131I標記胰島素以研究其代謝，他們比較了接受胰島素治療的病人和從未接受過胰島素的受試者的血漿，發(fā)現(xiàn)前者胰島素的消失速度比后者慢得多，提出外源胰島素的注射使病人體內(nèi)產(chǎn)生了抗體，與抗體的結(jié)合導致胰島素消失速度降低。第5頁/共113頁R.S.YalowS.A.Berson第6頁/共113頁由于胰島素抗體的濃度太低，用以往的免疫學技術(shù)不能測定，因此Berson和Yalow等人采用放射性標記法測定濃度極低的抗原-抗體復合物。電泳結(jié)果表明在接受胰島素治療的病人的血漿中，胰島素與一種球蛋白結(jié)合，證明胰島素抗體確實存在。第7頁/共113頁值得一提的是，在20世紀50年代中期，免疫學家還不能接受“胰島素抗體”這一概念。Berson和Yalow等人的論文被《Science》退稿，剛開始投《JournalofClinicalInvestigation》(JCI)也是退稿，后來向JCI的編輯作出妥協(xié)，從標題中刪去“胰島素抗體”字樣，論文才得以在JCI上發(fā)表。第8頁/共113頁Berson和Yalow等人的工作引發(fā)了免疫學上的一場革命。現(xiàn)在普遍認為一些小分子量的多肽如后葉加壓素和后葉催產(chǎn)素也可以是抗原。第9頁/共113頁在方法上，Berson和Yalow等人提出：當抗體已定量時，標記胰島素和抗體的結(jié)合與非標記胰島素的濃度成函數(shù)關(guān)系，這就為血漿胰島素的放射免疫分析提供了基礎。第10頁/共113頁在隨后的幾年中，他們又做了一些研究工作，包括胰島素與其抗體反應的定量和可得抗血清的物種特異性等，這些必要的工作使放射免疫分析由理論轉(zhuǎn)變?yōu)閷嵺`，于1959年首次完成人血漿(不進行抽提)胰島素的測定。第11頁/共113頁RIA具有技術(shù)簡易、價格便宜、特異性強和靈敏度高等優(yōu)點，廣泛用于生物醫(yī)學研究和臨床診斷。到20世紀60年代晚期，RIA已成為一項重要的分析技術(shù)。第12頁/共113頁據(jù)估計，在1975年的一年之中，全美進行RIA的臨床實驗室有4000個以上。Yalow因此榮獲1977年Nobel生理學或醫(yī)學獎(遺憾的是，Berson于1972年因心臟病逝世，未能共享殊榮)。第13頁/共113頁第2講放射免疫分析

的原理和特點當抗體初始濃度[Ab0]低于標記抗原初始濃度[Ag*0]和非標記抗原初始濃度[Ag0]之和時，非標記抗原Ag將與標記抗原Ag*競爭結(jié)合抗體Ab，分別生成非標記抗原-抗體復合物Ag-Ab和標記抗原-抗體復合物Ag*-Ab。第14頁/共113頁Ag*+AbAg*-Ab+AgAg-Ab第15頁/共113頁當[Ab0]和[Ag*0]都已確定時，如果[Ag0]低，則生成的Ag*-Ab多(其濃度B高)，剩余的標記抗原Ag*少(其濃度F低)，B/F值較高；相反，如果[Ag0]高，則B低，F(xiàn)高，B/F值較低。第16頁/共113頁在測定時，[Ab0]和[Ag*0]都是已知的。以B/F值為縱坐標，以標準溶液非標記抗原初始濃度為橫坐標制作標準曲線，得到回歸方程，在相同條件下測定未知非標記抗原的B/F值，即可用回歸方程求得未知非標記抗原的初始濃度。第17頁/共113頁0[Ag0]B/F標準曲線第18頁/共113頁

根據(jù)加樣順序與溫育次數(shù)的不同，放射免疫分析可分為如下三種。平衡法：將非標記抗原、抗體、標記抗原依次加入反應管，混勻后一次性溫育至反應達到動態(tài)平衡，再加分離劑使B與F分離。第19頁/共113頁順序加樣法：先將非標記抗原與抗體在反應管內(nèi)作第一次溫育，待反應達到動態(tài)平衡后，加入標記抗原，作第二次溫育，然后分離B與F。第20頁/共113頁急診檢測法：為臨床上快出結(jié)果而提出的反應方式，不等RIA反應達到動態(tài)平衡就終止反應。第21頁/共113頁放射免疫分析巧妙地結(jié)合了抗體抗原反應的高特異性和放射性核素標記的高靈敏度。RIA的靈敏度極高，可檢出0.1pg/ml(0.05pM)的胃泌激素。第22頁/共113頁相比之下，受體位點分析(receptorsiteassay)的最低檢出濃度一般至少是RIA的10-100倍。酶標記分析(enzymemarkerassay)由于作為標記的酶分子與抗原共價連接，抗原-抗體反應存在空間阻礙，分析靈敏度的降低幾乎不可避免。第23頁/共113頁第3講放射免疫分析的發(fā)展第1代(1959-1964)：Berson和Yalow等人于1959年首次提出了競爭抑制免疫反應原理，創(chuàng)建了RIA技術(shù)檢測人血漿胰島素的水平。1960年，Ekins根據(jù)RIA相同原理，以某些天然特異性蛋白作結(jié)合劑，建立了競爭結(jié)合蛋白分析法(CPBA)檢測血漿中的甲狀腺素、甾體類激素等小分子半抗原。因操作程序比較復雜，難以應用到臨床樣品的常規(guī)檢測。第24頁/共113頁第2代(1965-1970)：RIA技術(shù)的獨特優(yōu)勢受到生物醫(yī)學研究者的高度關(guān)注，許多學者對這一新的檢測技術(shù)進行了大量方法學的研究，在抗原-抗體復合物和游離標記抗原分離方法上取得了滿意的結(jié)果，簡化了實驗程序，將RIA和CPBA技術(shù)推進到了臨床實用水平，為建立試劑盒產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了條件。第25頁/共113頁第3代(1971-1980)：1970年Brown等人將三碘甲腺原氨酸(T3)和聚賴氨酸以共價鍵偶聯(lián)制成結(jié)合物(T3-PLL)，免疫動物獲得T3抗體，打破了半抗原不能制備出抗體的論斷，1971年Chopra首次完成了血清T4RIA方法的建立。從此，RIA完全取代了CPBA檢測小分子化合物，擴大了RIA技術(shù)應用范圍，推動了RIA試劑盒產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。第26頁/共113頁第4代(1981-1995)：早在l975年，Milstein和Kshler將綿羊紅細胞注射給小鼠，將獲得的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，得到了雜交細胞，經(jīng)培養(yǎng)、分離、成株等系列步驟后，首次制備出小鼠抗綿羊紅細胞的單克隆抗體(mAb)。這一重大研究成果為RIA及其他免疫分析技術(shù)提供了新型特異性抗體。進入20世紀80年代，mAb制備技術(shù)的完善和許多固相載體材料的研制成功，將試管固相、塑料球等包被mAb制成固相抗體，傳統(tǒng)IRMA技術(shù)的靈敏度、特異性和檢測量程度提高到了一個新水平。第27頁/共113頁第5代：近年來，磁性微粒子在標記免疫分析中的應用迅速，它是在磁性活性炭和磁性微球的基礎上發(fā)展起來的。磁性微粒子和磁性微球主要差別是直徑的大小和均一性。前者直徑為800-2000nm，均一性良好，在液體中具有較高的懸浮性，而磁性微球則否。磁性微粒子表面帶有活性基團，如-CONH2、-NH2和-COOH等，經(jīng)偶聯(lián)劑以共價鍵結(jié)合抗體制成磁性固相抗體。其包被量大、均一性高、牢固性強等特點是物理吸附難以比擬的。磁性微粒子固相抗體或固相親和素首先應用于CLIA試劑盒的制造，最近也應用于IRMA和RIA。第28頁/共113頁(1)液相雙標記IRMA技術(shù)：將兩株mAb分別標記125I和異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothicyanate，F(xiàn)ITC)作為標記試劑，檢測時將樣品和標記試劑加至試管中，溫育后加入磁性固相抗FITC，5min后，置于磁性分離器上，洗滌后即測量放射性。抗原和標記抗體在液相中反應生成雙抗體夾心復合物，免疫反應達到平衡所需時間比固相試管法更短，各項技術(shù)參數(shù)均超過目前廣泛采用的IRMA法。第29頁/共113頁(2)磁性固相第二抗體RIA競爭法：這一免疫反應模式實際上是一種新型的磁性二抗分離技術(shù)，有兩種不同的第二抗體可制成磁性固相供快速分離。一種是制備抗第一抗體的二抗磁性微粒子固相作分離劑，另一種是將第一抗體IgG標記FITC、抗FITC抗體和磁性微粒子結(jié)合作為分離劑，兩種分離劑檢測結(jié)果高度一致。與常規(guī)試劑盒相比，優(yōu)點是不必加復合二抗分離劑以及離心沉淀分離步驟，簡化了程序，縮短了時間，提高了精密度。第30頁/共113頁(3)磁性第一抗體固相RIA競爭法：此種免疫反應模式是將第一抗體制成磁性微粒子固相，檢測程序較磁性第二抗體分離劑法更簡便，可一步完成。只需將樣品、125I標記抗原和磁性微粒子固相抗體加至塑料管中，溫育后置磁性分離器上傾出上清液，經(jīng)一次洗滌后即可測量放射性強度。在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，此模式非特異結(jié)合過高，而操作人員又很難發(fā)現(xiàn)，從而降低了檢測技術(shù)的靈敏度和精密度，影響測值的準確性。第31頁/共113頁(4)自身抗體快速檢測法：許多臨床常見病、多發(fā)病的發(fā)病機理與自身免疫狀態(tài)關(guān)系密切，如甲狀腺疾病、糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，檢測相關(guān)自身抗體對臨床診斷及療效判斷是一種有價值的指標。采用磁性微粒子RIA技術(shù)，具有簡便、快速、特異性高等優(yōu)點，其原理是血清中的抗體和125I-抗原混合溫育，生成抗原-抗體復合物，然后反應液中加入抗人IgG磁性微粒子分離劑5min，置于磁性分離器上，棄上清液，測放射性。放射性強度與血清中自身抗體量呈正比。第32頁/共113頁(5)生物活性肽IRMA法：生物活性肽是一類分子量為(2-4)×103的肽類，參與多種生理生化代謝和互相調(diào)節(jié)過程，檢測這類物質(zhì)水平對研究心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展及防治具有重要意義。最近的實驗研究表明，生物活性肽在人血漿中以多種形式存在。既有前體物又有降解產(chǎn)物的片段，目前檢測這類化合物采用多抗RIA競爭法，抗體和降解物片段有不同程度的免疫反應，測值為待測物和降解物的總和，稱為免疫反應樣物質(zhì)，不能表示待測物的真實濃度。隨著肽合成技術(shù)的完善和mAb制備方法的改進，已可由生物制品公司提供肽的N端和C端肽類化合物片段及相應的mAb，使建立生物活性肽IRMA技術(shù)成為現(xiàn)實。研究者應用這一新的技術(shù)研制的人血清C-肽磁性微粒子RIA試劑盒，其各項方法學指標超過目前市場上的產(chǎn)品水平。第33頁/共113頁具有類似原理的其他分析方法免疫放射分析(IRMA)

標記的是抗體，分為如下兩種。單位點IRMA：抗原為小分子抗原，只有一個抗原決定簇，見下頁圖。第34頁/共113頁

上圖中ImAd-Ag為固相抗原免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原。Ag+Ab*Ag-Ab*+ImAd-AgImAd-Ag-Ab*第35頁/共113頁雙位點IRMA：又稱雙抗體夾心法，抗原有兩個抗原決定簇，所用的兩種抗體在與同一抗原結(jié)合時互不干擾，見下頁圖。第36頁/共113頁

上圖中ImAd-Ab為固相抗體免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗體。Ag+ImAd-AbImAd-Ab-Ag+Ab*ImAd-Ab-Ag-Ab*第37頁/共113頁

從加樣順序來看，雙位點IRMA分為如下三種。正向兩步法：待測抗原先與固相抗體結(jié)合，再與標記抗體結(jié)合，然后去除游離的標記抗體，測固相抗體-抗原-標記抗體復合物的放射性計數(shù)。第38頁/共113頁反向兩步法：待測抗原先與標記抗體結(jié)合，再與固相抗體結(jié)合，然后去除游離的標記抗體，測固相抗體-抗原-標記抗體復合物的放射性計數(shù)。第39頁/共113頁一步法：又稱同時加樣法，待測抗原與固相抗體和標記抗體同時反應，然后去除游離的標記抗體，測固相抗體-抗原-標記抗體復合物的放射性計數(shù)。第40頁/共113頁放射受體分析3H標記的四環(huán)素可與樣品中四環(huán)素類藥物競爭結(jié)合特異性受體，當樣品中殘留有四環(huán)素類藥物時，殘留藥物與受體結(jié)合，從而阻止了標記四環(huán)素與受體的結(jié)合。樣品中的四環(huán)素類藥物含量越高則結(jié)合的受體越多，而標記四環(huán)素結(jié)合的受體越少。第41頁/共113頁第4講放射免疫分析的應用

RIA除了用于測定胰島素、胃泌激素外，還被用于測定維生素B12和甲狀腺素等。在臨床上，用放射免疫分析可檢測β2-微球蛋白和鐵蛋白等。可用RIA測定的物質(zhì)如下：一、肽類激素垂體激素：生長激素、促腎上腺皮質(zhì)素、促黑激素(α-促黑激素、β-促黑激素)、糖蛋白類(促甲狀腺素、促卵泡激素、促黃體激素)、催乳素、促脂素、加壓素、催產(chǎn)素絨毛膜激素：人絨毛膜促性腺激素、人絨毛膜生長促乳素胰腺激素：胰島素、胰高血糖素、胰多肽第42頁/共113頁趨鈣激素：甲狀旁腺素、降鈣素胃腸激素：胃泌素、促胰液素、縮膽囊肽、血管活性腸多肽、胃抑制多肽血管活性組織激素：血管緊張素、緩激肽釋放抑制因子：促甲狀腺素釋放激素、促黃體激素釋放激素、促生長素抑制素其他肽：P物質(zhì)、內(nèi)啡肽、腦啡肽第43頁/共113頁二、非肽類激素甲狀腺激素：甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、反三碘甲腺原氨酸類固醇：醛固酮、皮質(zhì)類固醇、雌激素、雄激素、孕酮前列腺素生物胺：5-羥色胺、褪黑激素第44頁/共113頁三、非激素物質(zhì)藥物與維生素：強心苷、濫用藥物、精神活性藥物、抗生素、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑、維生素A、葉酸環(huán)核苷酸酶：C1酯酶、果糖1,6-二磷酸酶、纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶同工酶、醛糖還原酶、羧肽酶、胰彈性蛋白酶第45頁/共113頁病毒：肝炎相關(guān)抗原、鼠白血病病毒(粗病毒，勞氏病毒，莫氏病毒)、Mason-Pfizer猴病毒腫瘤抗原：癌胚抗原、甲胎蛋白血清蛋白：甲狀腺素結(jié)合球蛋白、免疫球蛋白(G、E、A、M)、備解素、纖維蛋白原、阿樸脂蛋白B、肌紅蛋白、髓基本蛋白其他：內(nèi)在因子、類風濕因子、凝血因子XII、后葉激素運載蛋白、葡萄球菌β腸毒素第46頁/共113頁第5講非標記抗原的準備制備標記抗原、特異性抗體和制作標準曲線都需要高純度的非標記抗原。非標記抗原純化的方法有：鹽析法、凝膠過濾法、離子交換法、柱層析法、親和層析法、免疫沉淀法、電泳法和高效液相色譜法等。第47頁/共113頁若是半抗原，則先要制備成人工抗原。對于具有氨基的半抗原，可用碳化二亞胺法合成與載體羧基以肽鍵連接的人工抗原，或者用戊二醛法合成與載體氨基以西佛堿鍵連接的人工抗原。第48頁/共113頁第49頁/共113頁第50頁/共113頁對于具有羧基的半抗原，可用碳化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成與載體氨基以肽鍵連接的人工抗原。第51頁/共113頁第52頁/共113頁具有羥基、酮基、酚基的半抗原先分別用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羥胺法、一氯醋酸鈉法和重氮化的對氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亞胺法或氯甲酸異丁酯法合成人工抗原。第53頁/共113頁第54頁/共113頁第55頁/共113頁第56頁/共113頁第57頁/共113頁第6講標記抗原的準備

多數(shù)采用125I標記抗原，標記方法有如下幾種。6.1氯胺-T法氯胺-T(N-氯-p-甲苯磺胺鈉，見下頁圖)在溶液中能緩慢釋放出次氯酸，該酸是一種溫和氧化劑，可將125I離子氧化成125I，后者可取代抗原Tyr殘基苯環(huán)上3和5位上的H。抗原中的各Tyr的碘化程度不一樣，取決于Tyr的暴露程度。第58頁/共113頁第59頁/共113頁不足之處是可能引起抗原免疫活性的丟失，原因在于：碘取代Tyr上的H改變了抗原性；內(nèi)照射損傷了抗原；氧化劑對抗原造成損傷；試劑中聚合的碘引起抗原損傷。第60頁/共113頁其操作流程為：將試劑溶解于磷酸緩沖液中，pH為7.4。在反應管中加入抗原5μg(10μL)。加Na125I37MBq(10μL)。加氯胺-T10μg(15μL)，邊加邊攪拌，三者混勻，反應1min。第61頁/共113頁加入Na2S2O5200μg(30μL)中止反應。紙層析測定標記率。SephadexG-50凝膠過濾分離、純化。測定標記抗原的放化純度、鑒定免疫活性、加防腐劑、加白蛋白稀釋，冷干，保存。第62頁/共113頁6.2酶促碘化法6.2.1乳過氧化物酶法用乳過氧化物酶催化H2O2放出O2，將125I離子氧化成125I。它比氯胺-T法溫和，副反應較少，一般不改變抗原的三維結(jié)構(gòu)，可得到高免疫活性和高比活度的標記抗原。第63頁/共113頁其操作流程為：將試劑溶解于0.4mol/L醋酸緩沖液，pH為5.6。在反應管中加抗原5μg(10μL)。加乳過氧化物酶25ng(10μL)。加H2O2200ng(10μL)。第64頁/共113頁加Na125I37MBq(10μL)。混勻，反應7min，再加上述H2O23μL，繼續(xù)反應7min。加入10mmol/L巰基乙醇0.5mL阻斷反應1min。加入載體NaI溶液1mL。上葡聚糖凝膠柱分離純化。第65頁/共113頁6.2.2葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能少量而不斷地、有控制地產(chǎn)生H2O2參與碘化反應，對標記抗原免疫活性的影響比乳過氧化物酶法更小。反應易于控制，加入葡萄糖即能啟動，加入含有0.1NNaN3的緩沖液即能停止。第66頁/共113頁6.3聯(lián)接碘化法某些抗原缺乏Tyr或Tyr的碘化降低了抗原的免疫活性，可用聯(lián)接碘化法。該法由Bolton和Hunter于1973年建立。主要步驟是先用氯胺-T法將3-(p-羥苯)-丙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯用125I標記，用苯抽提碘化產(chǎn)物，干燥后與抗原混合反應1h，碘化乙酰基以肽鍵與抗原的α-NH2或ε-NH2連接。第67頁/共113頁其優(yōu)點是可避免與氧化劑接觸而導致的損傷；一般不會使His碘化。缺點是可能使重要的Lys酰基化而影響抗原與抗體的結(jié)合。第68頁/共113頁6.4固相催化碘化法6.4.1Iodogen碘化法Iodogen即氯甘脲，化學名稱為1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯甘脲，是一種固相催化劑。主要步驟：將Iodogen1mg溶于25mL的二氯甲烷，取50μL加入反應管，用N2吹干有機溶劑，即在反應管底部形成Iodogen薄膜，加入Na125I和抗原，輕輕搖動，反應5-20min，即可標記抗原。第69頁/共113頁6.4.2Iodo-bead碘化法Iodo-bead是一種無孔聚苯乙烯小球，其上連接了氯胺-T衍生物(N-氯-苯磺酰胺鈉)。主要步驟：在2mL帶蓋的塑料試管中加入5μL抗原(5ng)，加45μL磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.1mol/L)，加2μLNa125I37MBq，加一粒或多粒Iodo-bead，立即蓋上蓋，反應5min，用移液管把反應液轉(zhuǎn)移到另一個試管。用緩沖液沖洗Iodo-bead和反應管，洗液與反應液合并，后經(jīng)純化。第70頁/共113頁6.5標記抗原的純化和鑒定標記后反應液中含有未標記抗原、損傷的標記抗原、未損傷的標記抗原、Na125I和磷酸鹽等，只有未損傷的標記抗原才是分析所需，其純化的方法有：離子交換法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、薄層層析法和高效液相色譜法等。第71頁/共113頁一般認為每個抗原分子標記上一個125I原子，對免疫活性影響不大，若標記上二個125I原子則可能對免疫活性有影響，因此要測定標記抗原的比活度。第72頁/共113頁比活度按如下公式計算：A×YW比活度=式中A為投入總放射性，Y為標記率，W為投入待標記抗原重量。第73頁/共113頁標記抗原的免疫活性鑒定可用理化方法如電泳法、吸附法和凝膠過濾法等，也可測定標記抗原與抗體的結(jié)合率，再測定標記抗原和非標記抗原對抗體的親和力是否一致。第74頁/共113頁第7講抗體的準備及標記抗原-抗體

復合物與標記抗原的分離7.1多克隆抗體抗原的乳化：將抗原與福氏完全佐劑(石蠟油2份、羊毛脂1份、每mL另加卡介苗5-10mg)混合制成乳化液。第75頁/共113頁免疫動物：一般用兔、豚鼠、山羊和綿羊作為免疫動物，多數(shù)采用純種家兔(1.5-2.0kg雄性健壯大耳白兔)，在同一批中應有足夠數(shù)量的兔子，以便從中挑選高質(zhì)量的抗體。免疫劑量：每只兔子注射1-2mg的抗原。第76頁/共113頁免疫部位：在兔頸、背部的皮內(nèi)、皮下多點注射或肌肉、腳墊及近淋巴結(jié)的大腿外側(cè)注射。免疫時間：對于大分子抗原，可在注射后6-8周采血測定抗體滴度。對于人工抗原，在注射后14-16周才可采血測定抗體滴度。第77頁/共113頁7.2抗體質(zhì)量鑒定特異性：若抗體與待測抗原的結(jié)合力強，與類似抗原的結(jié)合力弱，表示抗體特異性強。反之，表明類似抗原將對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾。第78頁/共113頁鑒定抗體特異性需作交叉反應，其方法是將類似抗原配成不同的濃度，按照待測抗原相同的條件制作標準抑制曲線，求得各自的半抑制濃度(IC50)，按Thornecroft法計算交叉反應率。第79頁/共113頁交叉反應率(%)=待測抗原的IC50類似抗原的IC50×100第80頁/共113頁親和力：抗體與抗原的親和力表示兩者結(jié)合的牢固程度。親和力大，則結(jié)合速度快、解離度小。反之，則結(jié)合速度慢、不牢固、易解離。第81頁/共113頁抗體親和力可用親和常數(shù)K表示。如果[Ab0]已確定，那么K=[Ag*-Ab][Ag*][Ab]==[Ag*-Ab][Ag*]([Ab0]?[Ag*-Ab])BF([Ab0]?B)B

F

=K[Ab0]?KB第82頁/共113頁K值可通過作Scatchard圖求得，以B/F值為縱坐標，以B濃度為橫坐標作直線回歸，所得直線斜率即為親和常數(shù)K。第83頁/共113頁滴度：抗體的稀釋倍數(shù)過高或過低均會影響分析的靈敏度和準確性。抗體的滴度反應其濃度。將抗體按一系列倍數(shù)稀釋，分別與定量的標記抗原反應，用分離劑將標記抗原-抗體復合物和標記抗原分離，以B/T%為縱坐標，以抗體的稀釋倍數(shù)為橫坐標作圖，B/T%為50%時的稀釋倍數(shù)即稱為抗體的滴度。第84頁/共113頁7.3單克隆抗體將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜交細胞，該雜交細胞產(chǎn)生的抗體只作用于一種抗原決定簇。將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞按2-10:1的比例混合，在50%的聚乙二醇作用下可實現(xiàn)融合，融合的成功率約幾萬分之一。第85頁/共113頁融合后在氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶（HAT）培養(yǎng)液中、5-7%的CO2、37℃的條件下培養(yǎng)。未融合的B淋巴細胞和骨髓瘤細胞幾天后漸漸死亡，只有融合的雜交細胞能在HAT培養(yǎng)液中生長傳代，經(jīng)10-14天的培養(yǎng)，雜交細胞形成克隆。第86頁/共113頁此時用免疫學方法檢測雜交細胞分泌的抗體，通過對千百個培養(yǎng)小孔中培養(yǎng)的上清液進行篩選，可發(fā)現(xiàn)一些抗體陽性的孔，盡快將能夠分泌所需抗體的高滴度陽性孔中的雜交細胞進行單細胞克隆。第87頁/共113頁重復上述檢測和克隆，確保得到的抗體是單個細胞后代分泌的。一旦雜交細胞能穩(wěn)定地產(chǎn)生高滴度抗體，即將該雜交細胞擴大培養(yǎng)。第88頁/共113頁其方法是將它注射到預先用降植烷或醫(yī)用石蠟油處理過的同種小鼠的腹腔內(nèi)，讓雜交細胞在腹腔內(nèi)生長，一般經(jīng)10-14天后，小鼠腹部脹大形成腹水，在其腹水或血清中含有高濃度的單克隆抗體。這種細胞若不用時，可在液氮中長期保存，需要時可取出擴大培養(yǎng)，可得到同質(zhì)的單克隆抗體。第89頁/共113頁7.4標記抗原-抗體復合物與標記抗原的分離雙抗體法：第一抗體與抗原結(jié)合，第二抗體與第一抗體結(jié)合，生成分子量較大的復合物(Ag-Ab1-Ab2)，能自然沉淀。優(yōu)點是分離效果好、非特異性結(jié)合率低，缺點是費用增加、需要第二次溫育、時間延長。第90頁/共113頁聚乙二醇(PEG)法：PEG濃度為7-9%時能使抗原-抗體復合物沉淀。優(yōu)點是經(jīng)濟、簡便，缺點是重復性差、非特異性結(jié)合率高。第91頁/共113頁活性炭吸附法：用包被了葡聚糖衣的活性炭吸附抗原，然后離心收集。鹽析法：用中性鹽如硫酸銨沉淀抗原-抗體復合物，然后離心收集。微孔濾膜法：用微孔濾膜吸附抗原-抗體復合物。第92頁/共113頁固相法：抗體與固體材料連接，生成的抗原-抗體復合物亦與固體材料連接。凝膠過濾法：利用葡聚糖的分子篩效應。雙抗體-PEG法：將兩種方法組合，沉淀抗原-抗體復合物。第93頁/共113頁磁化活性炭吸附法：將活性炭和氧化鐵混合，加入聚丙烯酰胺交聯(lián)成膠狀顆粒，吸附抗原后，將反應管放在磁鐵上，使顆粒沉淀。現(xiàn)在一般采用第二抗體與PEG合用的方法，稱為雙抗體-PEG法，它結(jié)合了兩種方法的優(yōu)點。第94頁/共113頁第8講放射免疫分析方法

的建立和鑒定8.1方法的建立8.1.1標記抗原、抗體和待測抗原的用量標記抗原的加入量一般為6000-10000cpm，抗體的滴度一般用與標記抗原結(jié)合率為30-50%時的滴度，待測抗原的含量應在標準曲線范圍內(nèi)，三者的容積為0.3-1.2mL。第95頁/共113頁8.1.2反應條件常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、Tris-HCl緩沖液、醋酸緩沖液和硼酸緩沖液。溫度一般為4℃或37℃

，在4℃下反應達到平衡所需時間長，但結(jié)合率較高；在37℃下反應達到平衡所需時間短，結(jié)合率較低。有的放射免疫分析先在37℃溫育一段時間，再在4℃下溫育。加樣均須在4℃下進行。第96頁/共113頁8.1.3樣品預處理和加樣順序若樣品中的待測抗原含量高，可先稀釋；可用溶劑萃取待測抗原，然后去除溶劑；可分離純化。后兩種方法必須測定回收率。按加樣順序不同分為平衡法和非平衡法。平衡法：將待測抗原、標記抗原和抗體依次加入、溫育。非平衡法：先加待測抗原和抗體、溫育一定時間，然后加入標記抗原、溫育。第97頁/共113頁8.1.4制作標準曲線和計算樣品含量計算標準結(jié)合率Bs/B0(%)：Bs/B0(%)=cpms

cpm0

×100cpms為標準抗原+標記抗原+抗體反應的平均計數(shù)率，cpm0為標記抗原+抗體反應的平均計數(shù)率。第98頁/共113頁令b=Bs/B0(%)，b的logit轉(zhuǎn)換logitb=loge

100?bb以標準抗原的劑量為橫坐標，若以Bs/B0(%)為縱坐標，則標準曲線是“L”形，若以logitb為縱坐標，則標準曲線是一條直線。第99頁/共113頁在與標準抗原相同的條件下測得樣品+標記抗原+抗體反應的平均計數(shù)率，計算樣品的結(jié)合率或其logit轉(zhuǎn)換，然后依據(jù)標準曲線方程求出樣品中的抗原含量。第100頁/共113頁8.2方法的鑒定8.2.1精密度精密度是指結(jié)果的重復性，即同一份樣品用同一種方法多次測量，若結(jié)果的標準誤差小，表示重復性好。在同一批測定中取高、中、低不同劑量，每個劑量至少作20個重復，得到的標準誤差為批內(nèi)誤差，應小于10%。第101頁/共113頁8.2.2準確性準確性是指測量值與真值的符合程度。將樣品分二份，一份加入已知量的標準品，測定加入標準品的回收率。平均回收率應為90-110%。回收率(%)=所加標準