原生質體的制備及融合生31盧文2003012377實驗目的：學習植物原生質體的分離制備技術，觀察原生質體形態。學習植物原生質體的融合技術，觀察融合原生質體時其形態及變化。實驗原理：詳見討論。實驗用品：顯微鏡、擦鏡紙、剪子、鑷子、小平皿、吸管、直式漏斗、300目尼龍網、10ml離心管、載玻片、蓋玻片。試劑：洗滌液：甘露醇 0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 2mMpH=5.6酶混合液：纖維素酶 1%果膠酶 0.5-0.7%甘露醇 0.6MCaCl2·2H2O 8mMNaH2PO4·H2O 7mMMES 3mMpH=5.6PEG溶液：PEG-6000 40%CaCl2·2H2O 3.5mMKH2PO4·H2O 0.7mM葡萄糖 0.3mMpH=5.8高Ca，高pH洗滌液：CaCl2·2H2O 100mMTris 50mM山梨醇 100mMpH=10.5蔗糖溶液：20%實驗步驟：原生體的制備將新鮮花瓣用蒸餾水洗干凈，用濾紙吸干表面水分。用尖頭鑷剝去木料的下表皮或將其剪成小細條，加入幾滴酶液恒溫振蕩半小時。酶解好的原生質體混合液經300目尼龍網過濾到10ml離心管，加入少量洗滌液定容至4ml，此時，未被酶解的大塊組織留在尼龍網上。500rpm離心5分鐘，棄去上清液，加洗滌液至約2ml吹打均勻。500rpm5min重復離心一次，徹底去除酶液。加8滴洗滌液，懸浮原生質體。鏡檢，檢察原生質形態和濃度，看看是否有碎片，本試驗中碎片較少，故未做蔗糖漂浮。PEG融合：在小平皿內各滴三滴原生質體懸液，靜置沉淀。各緩緩滴加一滴PEG在其中兩滴原生質體懸液上，在另一滴上滴加一滴高Ca2+高pH洗液。鏡下觀察，1-2分鐘后，在原先加入PEG的一滴懸液上加入一滴高Ca2+高pH洗液。鏡檢，記錄結果。實驗結果：（詳見附圖）加樣種類現象PEG視野中的原生質沒有明顯的大范圍的聚集運動，但原本挨得很近的原生質迅速的融合。高Ca2+高pH視野中的原生質有大范圍的聚集運動，過一段時間后逐漸有原生質融合現象。PEG+高Ca2+高pH視野中的原生質有大范圍的聚集運動，并可以迅速融合，和只加高Ca2+高pH的對照組區別不是很明顯。實驗討論：關于幾種融合技術的討論：物理融合技術：現在常用的物理融合技術有電融和和激光融合技術。電融和：Zimmermann在1978年首先采用電脈沖方法成功地誘導了細胞融合,開創了細胞融合技術的新局面。它實現了裝置化,比病毒法,化學法操作起來方便些,物理參數易精確測量,重復性較好的優點。電融合法的過程可分為兩步:①電介質電泳。在電融合槽的電極上輸出一個正弦交流電,形成一個非均勻電場,細胞在非均勻電場中被極化,形成偶極子,細胞向高場強區移動。極化細胞在電介質電泳下相互接近時,由于偶極子相互作用,相互吸引,所以細胞在融合槽中排列成珠鏈狀。為了形成細胞珠鏈,必須選擇合適的交流電場強度,使細胞所受電場力大于引起布朗運動的隨機力,為此,Schwen和Sher進行了理論分析,得出該電場強度的閾值。②瞬時可逆擊穿細胞排成珠鏈狀后,在電極上輸出單個或多個方波脈沖。使細胞膜上產生可逆性小孔,導致細胞融合。關于電脈沖融合細胞機理,Zimmermann認為電融合過程的分子機制是:通過電泳,兩細胞膜緊密接觸,且膜表面的蛋白質分子分離,產生了無蛋白的類脂區。電脈沖作用時引起膜結構局部擾亂,出現小孔洞。而相對的脂雙層間分子在范德瓦爾斯作用力下,形成脂分子橋,由于連接處的細胞膜表面曲率大,處于高張力狀態,在熱力學上是不穩定的,所以最終導致兩細胞逐漸融合成一個圓形的大球狀細胞。但SubrataBiswas于1999年報道,通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察到兩細胞膜間有膜突起物,細胞膜就是依靠這些微伸出物連接起來的,并沒有觀察到微小孔洞的存在。圖1：電融和過程示意圖。化學融合：現在普遍應用的化學融合方法是通過PEG進行介導的方法。PEG融合：利用PEG介導的動物細胞融合，其實驗原理到目前為止還沒有完全定論。學者們一般認為，PEG改變各類細胞的膜結構，使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發生疏散、進而使其結構發生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質膜在修復時相互合并在一起,使兩細胞的胞質溝通,從而造成相互接觸的細胞之間發生融合。現在的流行的假設有兩種：一種時說PEG分子吸附在膜的表面，通過長分子的牽拉和吸附作用使原生質表面間形成分子橋面聚集；還有一種假設是說PEG分子在膜表面的耗減，或者說脫離，產生的范德華力使細胞聚集以致融合。近來的一些實驗通過對水溶液和PEG溶液中膜表面的粘滯性的精確測量指出在PEG中細胞表面的粘滯性更接近水溶液中的，而并非大量PEG中，由此間接支持了第二種假設。但是個人認為，這個假設是否成立還有待于更直接的實驗證據。PEG法將病毒法誘導產生雜交細胞的頻率由10-5提高到10-3。PEG誘導細胞融合的效果,同其相對分子質量大小及濃度高低、作用時間、PH值密切相關。PEG相對分子質量、濃度增大,促進細胞融合的能力提高了,但它對細胞的毒性也隨之增大,故通常選相對分子質量在1000-6000,濃度在30%-50%的PEG,并且嚴格控制PEG的作用時間,減少它對細胞的毒性,PH值一般選在7.4--8.0之間。現在采用PEG時,一般是同時采用高pH值，高Ga2+濃度的溶液來促進細胞膜融合,或加入二甲基亞砜(DMSO)來提高PEG誘導細胞融合。特別是在低相對分子質量和較低濃度的PEG中,DMSO的效果更加突出。生物融合：現在普遍應用的生物融合方法是通過病毒介導的方法。病毒介導融合：副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendaivirus)和新城雞瘟病毒，在其被膜中目前發現了兩種糖蛋白。較大的一種具有粘附細胞和凝血的作用；較小的一種可介導病毒同宿主細胞融合,也可誘導細胞與細胞融合，稱為融合蛋白(fusionprotein)。人工利用病毒誘導細胞融合即是利用病毒的這一特性,使用時先用紫外線將病毒滅活,稀釋到一定濃度加入到細胞懸液中,誘導細胞融合。但病毒介導細胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖與滅活，操作繁瑣，如滅活不完全則易對實驗人員造成傷害，因此現在一般不使用此方法。關于原生質制備的討論植物原生質體分離期間所用細胞壁降解酶和高滲介質對細胞生理影響甚大其不良因素首先反應在膜的變化上。花生原生質體酶解脫壁后膜脂質過氧化產物丙二醛MDA含量升高導致了膜損傷且損傷程度隨時間延長而明顯增大損傷，其原因可能與自由基在酶解過程中的過量產生有關。有實驗證明添加抗壞血酸(ASA)能降低MDA的積累未添加ASA時酶解初期過氧化物酶(POD)過氧化氫酶(CAT)活性上升說明原生質體存在各種抵御不良變化的機制但酶解時間加長POD活性下降添加ASA能使超氧化物歧化酶SOD活性明顯上升。酶解過程中植物細胞自身存在著對原生質體膜受損的防御機制細胞中的SOD能催化O2-與HO歧化為O2和H2O2，H2O2又可被細胞中的POD、CAT催化轉變為H2O和O2因而可起保護作用。花生原生質體酶解過程中POD、CAT活性均出現上升，但酶解時間過長會導致細胞部分受損，因此12h后POD活性又有所下降，而CAT活性在12h內仍一直上升是由于酶解使細胞部分受損后產生了生理生化環境的改變POD對這種改變比CAT敏感。實驗表明酶解液中添加ASA后MDA含量明顯下降，說明ASA抑制酶解過程對原生質體膜損傷的作用，而添加ASA后SOD活性明顯上升，SOD能清除O2-抵御或減輕膜脂質過氧化對細胞造成的損傷。另外ASA本身直接參與O2-、H2O2等活性氧的清除，使細胞內物質和膜系統受到保護。因此酶解過程中添加ASA有利于原生質體的培養和再生。關于實驗所用的四種溶液滲透壓的討論：洗滌液：此溶液為高滲溶液，因為在不斷洗滌的過程中，用高滲的溶液使細胞有一些皺縮可以避免原生質在離心和洗滌的過程中破裂，產生碎片影響實驗結果。酶混合液：此溶液為高滲溶液，因為在酶解的過程中，用高滲的溶液使原生質有一些皺縮可以避免原生質在酶解的過程中的破裂，可以保持原生質中的結構安全。PEG溶液：此溶液應為低滲溶液，使細胞稍微的鼓脹可以使細胞膜變薄，利于細胞融合的過程。高Ca，高pH洗滌液：此溶液也應為低滲溶液，理由同PEG溶液，利于細胞的融合。參考文獻S.W.Huia.Useofpoly(ethyleneglycol)tocontrolcellaggregationandfusion.ColloidsandSurfacesB:Biointerfac