新型有機酸的發酵法制備技術第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五報告內容

一.新型有機酸概況二.新型有機酸發酵研究進展舉例丙酮酸發酵丙酸發酵

α-酮戊二酸發酵三.新型有機酸發酵工業展望第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五一、新型有機酸概況

第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五新型有機酸概述檸檬酸乳酸α-酮戊二酸丙酸琥珀酸衣康酸葡萄糖酸丙酮酸有機酸是指一些具有酸性的有機化合物。最常見的有機酸是羧酸，其酸性源于羧基

(-COOH)第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五新型有機酸概述新型有機酸是指一系列在食品、醫藥和化工等領域具有重要應用價值，但是長期以來由于結構復雜性和較高的化學反應活性無法在工業規模進行低成本生產的有機酸。其中丙酮酸、-酮戊二酸和丙酸等，由于化學合成工藝復雜，成本長期維持在10萬元/噸以上(普通有機酸價格僅為0.4-1萬元/噸)，導致下游產品成本居高不下，妨礙了其大規模應用。第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五二.新型有機酸發酵研究進展－丙酮酸第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五丙酮酸的應用領域丙酮酸農業：阿托酸、谷物保護劑等多種農藥合成前體食品工業：

功能飲料添加劑

減肥食品酸味劑醫藥工業：原料藥藥物合成前體藥物佐劑日化工業：防腐劑抗氧化劑診斷檢測試劑：伯醇/仲醇檢定轉氨酶測定脂肪族胺顯示劑第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五丙酮酸的生產方式比較化學法代謝工程改造：酶轉化法發酵法篩選得到的菌種：光滑球擬酵母釀酒酵母大腸桿菌原料成本高環境污染嚴重原料成本高來源有限最適pH值高易感染噬菌體丙酮酸耐受性差轉化率較低，副產物多生產周期較長發酵過程不穩定最適pH值低不易染菌無噬菌體高丙酮酸耐受性第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五發酵法生產丙酮酸GlucosePyruvateGlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1,NA)PDC(B1)PT(B6)PC(Bio)B1：硫胺素NA：煙酸Bio：生物素B6：吡哆醛

30

60

90

120

2

4

6

8

0.01

0.02

0.03

0.04

0.1

0.2

0.3

0.4

0.01

0.02

0.03

0.04

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

0

0.05

0.1

0.15

10

20

30

40

50

0

20

40

60

80

0

丙酮酸

/g×L-1

0

0

0

0

150

煙酸

/mg×L-1

硫胺素

/mg×L-1

吡哆醇

/mg×L-1

生物素

/mg×L-1

核黃素

/mg×L-1

葡萄糖消耗

/g×L-1

細胞生長

/OD660

丙酮酸產率

/g×g-1

選育維生素缺陷型酵母光滑球擬酵母丙酮酸代謝優化培養基中維生素供給XXXX菌株選育第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五不同kLa下發酵動力學曲線不同kLa下溶氧、產率變化ConstantkLa

/h-1Parameters450300200r

(IG)/(g/L)118.6119.4124.8r

(RG)/(g/L)

11.9

13.2

6.4Totalfermentationtime/h

85

68

60Glucoseconsumptionrate/(g/(L?h))1.141.561.97w

(Glucoseconversion)/%

90.0

88.9

94.9r

(Pyruvate)/(g/L)

77.3

69.0

57.2Productivity/(g/(L?h))

0.91

1.01

0.95Yp/s

/(g/g)0.7240.6490.483d

(DCW)/(g/L)

13.2

14.5

15.6Averagem

ofthefirst16h/h-1

0.238

0.190

0.139Averagem

oftheprocess/h-1

0.047

0.073

0.084r

(NH4Clconsumption)/(g/L)

5.66

5.88

6.06r

(KH2PO4

consumtion)/(g/L)

1.35

1.23

1.12r

(Ethanol)/(g/L)

1.34

1.55

1.67不同供氧控制模式下發酵過程參數高溶氧下，丙酮酸產率較高(0.724g/g)，葡萄糖消耗速度(生產強度)較慢(1.14g/(Lh))低溶氧下，細胞消耗葡萄糖速度加快(1.97g/(Lh))，丙酮酸產率(0.483g/g)卻明顯下降不同供氧控制模式下發酵過程參數丙酮酸產率細胞產率發酵法生產丙酮酸第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五代謝網絡分析DO=10%DO=85%高溶氧下轉化率高的原因:DO從85%到10%，PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸代謝的通量下降了63.3%輔因子分析低溶氧下生產強度提高原因：DO從85%到10%，總ATP、NADH下降31.4%、18.6%，糖耗速度上升59%總ATP下降31.4%,NADH下降18.6%生產強度(糖耗速度)DO=10%DO=85%采用單一供氧模式(高或低)，不能同時達到高轉化率和高生產強度發酵法生產丙酮酸第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五實現相對統一高產量(69.4g/L)高產率(0.636g/g)高生產強度(1.95g/(Lh))

分階段供氧模式發酵0-16h控制kLa為450h-1發酵16h后將kLa降低至200h-1發酵過程碳平衡分析前16h較高溶氧有利于碳流合成細胞；16h后耗氧速率恒定，碳流轉向合成丙酮酸必須進行分階段溶氧控制！如何分階段？發酵法生產丙酮酸第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五美國科學院院士LO.Ingram在PNAS上的論文11次引用本團隊丙酮酸高效合成的論文，并比較表明本團隊獲得了國際最高發酵水平。

2篇有關丙酮酸發酵微生物生理特性和優化技術的博士論文2009、2011年分別獲發酵工程領域至今唯一的兩篇全國優秀博士論文被世界上最大發酵公司之一日本味之素公司購買，為該公司從中國購買的唯一技術發酵法生產丙酮酸第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五二.新型有機酸發酵研究進展－丙酸第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五丙酸的應用及市場2012:260mlbs(117,936tonnes)化學法：2萬/噸發酵法：6萬/噸（食品安全）丙酸鈣價格06年全球產量37.7萬噸75%用于谷物和飼料防腐第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五消費者熱衷于使用天然、綠色、健康的發酵級丙酸鈣作為食品防腐劑化學合成法微生物發酵法烴氧化法、乙烯羰基化法食品安全問題原料廉價、可再生過程綠色、環保環境污染嚴重資源不可再生微生物發酵法——低碳、環保、綠色、安全!丙酸的生產方法第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五丙酸桿菌代謝工程改造策略過量表達甘油脫氫酶（gldA），提高對甘油的利用速率過量表達蘋果酸脫氫酶（mdh），富馬酸水合酶（fumC），提高丙酸代謝途徑通量gldAmdhfumC丙酸發酵的問題丙酸桿菌對碳源利用率低，生長慢；代謝途徑過程中存在若干限速酶，大大抑制了丙酸的積累第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五篩選丙酸高產菌從奶制品廠取樣低丙酸濃度富集高丙酸濃度初篩產量檢測復篩242529303236菌種鑒定篩選野生型質粒細胞壁裂解條件優化

Blank12345678Lysozyme00.500.50.51110ProteinaseK000.50.510.5101Result---++++--條件:溶菌酶20mg/mL37oC,蛋白酶K2mg/mL56oC.“-”表示細胞壁沒有裂解.“+”表示細胞壁被裂解.菌種是否含有質粒P.a×25×32√29×30×24×36×質粒電泳圖質粒鑒定分析質粒ORF轉錄水平分析丙酸高產菌、野生質粒的篩選以及質粒分析第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五過量表達甘油脫氫酶電轉化241000菌落PCR菌種鑒定Marker100012Marker151110001235371000Marker100012野生菌與工程菌分批發酵對比△:丙酸(PA),□:甘油濃度,▲:細胞干重(DCW),■:乙酸(AA),◆:琥珀酸(SA),?:甘油脫氫酶比酶活.2929(pZGX03-gldA)菌株PA(g/L)YP/S(g/g)YP/A(g/g)rPA/Glycerol(g/g)生產強度(gL-1h-1)2922.0614.618.20.730.1529(pZGX03-gldA)28.23239.080.9410.20過量表達甘油脫氫酶工程菌的丙酸產量比野生菌提高了28%第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五過量表達丙酸代謝限速酶GenomeofKlebsiellapneumoniaeBluntingligationBluntingligationmdhfumCP.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)和P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)分批補料發酵□,glycerol;△,PA;▲,LA;■,DCW;◆,AA.富馬酸水合酶基因和蘋果酸脫氫酶基因表達載體的構建第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五過量表達丙酸代謝限速酶菌株周期(h)DCW(g/L)副產物(g/L)生產強度(g?L-1?h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA)2283.4134.622.862.600.15228.46P.jenseniiATCC4868(pZGX04-fumC)2283.3434.522.832.570.15628.09P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh)2283.3536.092.702.510.16433.91不同菌株丙酸發酵參數對比過量表達甘油脫氫酶基因的工程菌丙酸產量比出發菌提高了28.46%過量表達富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產量比出發菌提高了28.09%過量表達蘋果酸脫氫酶基因的工程菌丙酸產量比出發菌提高了33.91%第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五共表達關鍵限速酶mdh-fumCElectrotransformation富馬酸水合酶基因和蘋果酸脫氫酶基因共表達載體的構建示意圖三株共表達載體pZGX04-gldA-mdh,pZGX04-gldA-fumC,pZGX04-mdh-fumC的物理圖譜第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五共表達關鍵限速酶不同菌株丙酸分批發酵參數對比共表達蘋果酸脫氫酶和富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產量比出發菌提高了36.73%共表達甘油脫氫酶和富馬酸水合酶基因的工程菌丙酸產量比出發菌提高了39.22%共表達甘油脫氫酶和蘋果酸脫氫酶基因的工程菌丙酸產量比出發菌提高了46.31%菌株周期(h)DCW(g/L)副產物(g/L)生產強度(g?L-1?h-1)提高(%)丙酸乳酸乙酸P.jenseniiATCC48682283.6526.952.722.410.118-P.jenseniiATCC4868(pZGX04-mdh-fumC)2283.1636.852.652.330.16236.73P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-fumC)2283.2637.522.852.510.16539.22P.jenseniiATCC4868(pZGX04-gldA-mdh)2283.2839.432.742.550.17346.31第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五氧化還原電位（ORP）發酵優化不控制ORP分批發酵□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸;

，ORP.不控制ORP發酵，ORP下降迅速，后期產酸能力低第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五氧化還原電位（ORP）發酵優化不同ORP對分批發酵的影響□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸高ORP條件下，菌體濃度高；低ORP條件下，單位菌體產酸能力高第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五氧化還原電位（ORP）發酵優化三階段ORP控制對分批發酵的影響□,甘油;△,丙酸;○,pH;▲,乳酸;■,DCW;◆,乙酸提出三階段ORP控制策略：0-36h，控制ORP為-200mV；36-156h，控制ORP為350mV，156h后控制ORP為-400mV。三階段ORP控制分批發酵丙酸產量比不控制ORP發酵提高了27.7%第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五10m3發酵罐放大試驗丙酸10m3罐中試發酵過程曲線—□—residualglycerol,—△—PA,—■—DCW,—▲—SA,—*—AA丙酸最高產量為47.28g/L，生產強度為0.197g·L-1h-1全球第二家采用發酵法生產丙酸第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五二.新型有機酸發酵研究進展－α-酮戊二酸第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五

-酮戊二酸的應用降低病患機體損耗清除自由基，延緩衰老提高繁殖率，促進骨骼的生長有機中間體體格增強劑、運動飲料添加劑醫藥化妝品食品化工飼料第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五

-酮戊二酸市場概況國際市場食品級-酮戊二酸潛在市場容量約為1萬噸

名稱價格(RMB/Kg)純度用途-酮戊二酸28098%醫藥、化工中間體L-精氨酸：-酮戊二酸鈉鹽(2:1)35099%運動飲料添加劑L-鳥氨酸：-酮戊二酸鈉鹽(1:1)65099%運動飲料添加劑第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五化學法發酵法篩選得到的菌種：解脂亞諾酵母

-酮戊二酸的生產方法生產效率低、環境非友好和有毒試劑使用，限制其在醫藥、保健品和食品等高附加值產品生產應用生產效率高環境友好食品安全性高第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五食品安全級生物法生產-酮戊二酸土壤樣品維生素B1缺陷型篩選500株微生物菌株0.1g/L13.4%0.1-1g/L74.4%1-10g/L6.4%10g/L5.8%菌落形態AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAATACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATTGGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG18SrRNAYarrowialipolyticaWSH-Z06第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五生物法生產-酮戊二酸的關鍵問題當以甘油為唯一碳源時，發酵6天后-KG產量可達30g/L左右，但是發酵液中同時會積累大量的副產物—丙酮酸(30g/L左右)。Y.lipolyticaWSH-Z06搖瓶發酵曲線-KG(■),Glycerol(●),Pyruvate(▲),DCW(▼)

存在的問題第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五1.輔因子調控3.節流2.開源4.調控轉運蛋白解決方案——代謝工程改造解脂亞洛酵母第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五代謝工程改造解脂亞洛酵母1.輔因子調控第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五調控乙酰輔酶A代謝促進-酮戊二酸的積累CONACS1/ACLCONACS1ACL過量表達ACS1基因使胞內ACS比酶活達到0.92U/mgprotein，過量表達ACL基因使胞內ACL酶活達到了1.51U/mgprotein，比對照分別提高了10.5和11.6倍，胞內乙酰輔酶A含量分別是對照的231.2%和244.2%。第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五調控乙酰輔酶A代謝促進-酮戊二酸的積累過量表達ACS1和ACL基因對菌體生長和-酮戊二酸合成的影響■:-KG;●:Glycerol;▲:pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACS1;(C):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ACL.提高16.2%提高28.6%Y.lipolytica-ACS1和Y.lipolytica-ACL中-酮戊二酸的產量分別為42.2g/L和46.7g/L，比對照菌(36.3g/L)分別提高了16.2%和28.6%。丙酮酸產量分別為14.5g/L和10.6g/L，比對照菌(21.2g/L)分別降低了31.6%和50%。第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五代謝工程改造解脂亞洛酵母2.開源第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五強化丙酮酸羧化途徑促進-酮戊二酸的積累6.5倍10.2倍CONScPYC1RoPYC2表達載體p0(hph)-ScPYC1和p0(hph)-RoPYC2的構建Y.lipolytica及其突變株胞內PC酶活轉化子提取基因組進行PCR驗證第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期五強化丙酮酸羧化途徑促進-酮戊二酸的積累過量表達ScPYC1和RoPYC2基因對菌體生長和-酮戊二酸合成的影響■:-KG;●:Glycerol;▲:Pyruvate;▼:DCW(A):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-CON;(B):Thetime-coursesoffermentationinY.lipolytica-ScPYC1;(C):Thetime-coursesoffermentation