核酸提取經驗及原理總結

時間：2008.4.21主要內容一、核酸的發現、核酸的分類和功能、核酸的理化性質二、細胞裂解三、核酸提取四、核酸純化五、核酸檢測六、核酸除雜質

核酸的發現核酸是1869年米歇爾(F.Miescher)在膿液的白細胞中發現的，他當時稱之為核素。阿爾特曼(R.Altmann)于1889年認識其酸性后，定名為核酸。核酸分為核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)兩大類。核糖核酸（RNA）RNA主要是負責DNA遺傳信息的翻譯和表達，分子量要比DNA小得多。RNA為單鏈分子，根據RNA的功能，可以分為三種：信使核糖核酸（mRNA）；轉運核糖核酸（tRNA）；核蛋白體核糖核酸（rRNA）。核酸的理化性質RNA的純品都呈白色粉末或結晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離核酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達40g/L，DNA鈉鹽在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。細胞裂解裂解原理細胞的裂解方法裂解方法的評價樣品與裂解液的比例細胞裂解-細胞的裂解方法

機械方法化學試劑法反復凍融法酶解法細胞裂解-裂解方法的評價含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組DNA的首選。高濃度蛋白質變性劑(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首選。含CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組DNA抽提的首選裂解方法。SDS堿裂解法是質粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組DNA污染的特點。細胞裂解-樣品與裂解液的比例裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質的過程復雜且不徹底，導致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質的含量為基準的，而不是以核酸含量為基準，這一點務必牢記。DNA提取的幾種方法1濃鹽法2陰離子去污劑法4水抽提法3苯酚抽提法RNA提取總RNA的試劑盒快速提取

蛋白酶－熱酚法氯化鋰法提取總RNA核酸純化-方法經典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術使用離子交換介質的純化技術密度梯度離心法使用吸附介質的純化技術核酸純化-醇的沉淀沉淀的原理目的沉淀劑的選擇沉淀溫度的選擇核酸純化-醇的沉淀-目的目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現核酸與其它雜質–主要是鹽的分離。核酸純化-醇的沉淀-沉淀劑

醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我們沒有發現這二者對質量有大的影響，雖然許多人“發現”乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現象，提示結論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。因此，少量核酸用異丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。核酸純化-核酸的洗滌洗滌目的方法首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要控制一定的時間，尤其是當核酸沉淀比較大時(使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。核酸純化-核酸的溶解其中RNA以水為主，DNA則多以弱堿性的Tris或者TE溶解。核酸純化-核酸保存核酸在保存中的穩定性，與溫度成反比，與濃度成正比。一般的我們選擇，-20℃或70℃保存的穩定。如果溫度不合適，保存中核酸發生降解或者消失，首要原因是酶殘留導致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的pH值不合適導致的水解。還有一個不為人重視的，就是EP管對核酸的影響。核酸質量的檢測問題關于紫外分光光度儀的檢測關于電泳檢測關于紫外分光光度儀的檢測在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組份定性和定量測定的依據。核酸中除雜質-肝糖元、淀粉及粘多糖①取材前盡量減少組織中多糖的含量，如先使動物饑餓數天然后殺死，可使細胞內肝糖元大大減少。②加入淀粉酶，將大分子多糖分解為小分子，在以后純化步驟中逐漸被除去。③在濃磷酸鹽存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下層水相，核酸在上面有機層中。④以鈣鹽沉淀DNA，再以草酸鉀處理，使之形成DNA鉀鹽回收，然后用離子交換法吸附DNA，使之與多糖分離。核酸中除雜質-蛋白質的除去①加入去污劑如硫酸十二脂鈉，從提取到分離純化各階段均可反復使用此法。去污劑與氯仿法或苯酚法結合使用，效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇對提取液搖蕩抽提，蛋白質在氯仿-水界面形成凝膠，離心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分離純化中也常反復使用。③苯酚水溶液抽提，在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，DNA或RNA都可以進入水相，蛋白質則沉淀于酚層，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，殘余的酚可用葡聚糖凝膠G-10或G-25除去。核酸中除雜質-不同類型核酸的分離在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是較有效和常用的方法。在DNA中加核糖核酸酸酶選擇地破壞RNA，是除R