第十二章細(xì)胞增殖及其調(diào)控●細(xì)胞周期概述●細(xì)胞分裂●細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞增殖(cellproliferation)的意義細(xì)胞增殖(cellproliferation)是細(xì)胞生命活動的重要特征之一,是生物繁育的基礎(chǔ)。單細(xì)胞生物細(xì)胞增殖導(dǎo)致生物個體數(shù)量的增加。多細(xì)胞生物由一個單細(xì)胞(受精卵)分裂發(fā)育而來。成體生物仍然需要細(xì)胞增殖，主要取代衰老死亡的細(xì)胞，維持個體細(xì)胞數(shù)量的相對平衡和機(jī)體的正常功能。機(jī)體創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理組織修復(fù)等，都要依賴細(xì)胞增殖。第一節(jié)細(xì)胞周期(cellcycle)概述概念：

細(xì)胞從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開始到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止，所經(jīng)歷的一個有序過程,包括物質(zhì)準(zhǔn)備和細(xì)胞分裂過程。其間細(xì)胞遺傳物質(zhì)和其他內(nèi)含物分配給子細(xì)胞。細(xì)胞周期時間不同細(xì)胞的細(xì)胞周期時間差異很大.S+G2+M的時間變化較小，細(xì)胞周期時間長短主要差別在G1期.有些細(xì)胞會暫時離開細(xì)胞周期，停止分裂，成為靜止期或G0期細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞周期可將高等動物細(xì)胞分為3類：①連續(xù)分裂細(xì)胞，如表皮生發(fā)層、骨髓干細(xì)胞。②休眠細(xì)胞，暫不分裂，適當(dāng)刺激下可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等。③不分裂細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，不再分裂，如神經(jīng)元、肌肉、多形核細(xì)胞等。細(xì)胞周期的人工選擇同步化·有絲分裂選擇法：用于單層貼壁生長細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞未經(jīng)任何藥物處理，細(xì)胞同步化效率高。缺點(diǎn)是分離的細(xì)胞數(shù)量少。·密度梯度離心法：根據(jù)不同時期的細(xì)胞在體積和重量上存在差別進(jìn)行分離。優(yōu)點(diǎn)是方法簡單省時，細(xì)胞同步化效率高，分離的細(xì)胞數(shù)量多。缺點(diǎn)是對大多數(shù)種類的細(xì)胞并不適用。適用于姴殖酵母（fissionyeast)和有些哺乳動物細(xì)胞（如HeLa)。藥物誘導(dǎo)法同步化·DNA合成阻斷法：常用試劑如HU（hydroxyurea，羥基脲),

TdR(胸腺嘧啶核苷）。單次處理可將細(xì)胞群同步化于G1/S交界處和S期。TdR兩次處理可將細(xì)胞群同步化在G1/S交界處。優(yōu)點(diǎn)是同步化效率高，幾乎適合于所有體外培養(yǎng)的細(xì)胞體系，被廣泛采用。·

分裂中期阻斷法：常用試劑如nocodazole，通過抑制微管聚合來抑制細(xì)胞分裂器的形成，將細(xì)胞群同步化在M期。優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，效率高。缺點(diǎn)是這些藥物的毒性相對較大，若處理時間長，細(xì)胞常不能恢復(fù)細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)。

條件依賴性突變株在細(xì)胞周期同步化中的應(yīng)用：可用于酵母細(xì)胞的同步化，極少用于動物細(xì)胞。將與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的條件依賴性突變株轉(zhuǎn)移到限定條件下培養(yǎng)，所有細(xì)胞便被同步化在細(xì)胞周期中某一特定時期。第二節(jié)細(xì)胞分裂一、有絲分裂(mitosis)●前期(prophase)●前中期(prometaphase)●中期(metaphase)●后期(anaphase)

●末期(telophase)高等動物細(xì)胞的有絲分裂期可分為：前期(prophase)◆標(biāo)志前期開始的第一個特征是染色質(zhì)開始濃縮(condensation)，光鏡下可見早期染色體結(jié)構(gòu)。◆在前期末，染色體主縊痕部位形成一種蛋白復(fù)合物稱為動粒(kinetochore)，又稱著絲點(diǎn)，與著絲粒（centromere）緊密相連。◆2個中心體周圍，微管組裝并以中心體為核心向外發(fā)散，形成2個星體。2個星體逐漸向2極運(yùn)動而確立細(xì)胞分裂極。◆Golgi體、ER等細(xì)胞器解體，形成小的膜泡前中期(prometaphase)◆核膜破裂，核纖層解體。◆紡錘體微管侵入細(xì)胞核與染色體的動粒結(jié)合，捕捉住染色體。◆不斷運(yùn)動的染色體開始移向赤道板。前中期中期后期(anaphase)

◆排列在赤道面上的染色體的姐妹染色單體分離產(chǎn)生向極運(yùn)動◆后期(anaphase)大致可以劃分為后期A和后期B

·后期A，動粒微管去裝配變短，染色體產(chǎn)生兩極運(yùn)動

·后期B，極間微管長度增加，兩極之間的距離逐漸拉長，介導(dǎo)染色體向極運(yùn)動。用破壞微管的藥物，如nocodazole或秋水仙堿處理，染色體的運(yùn)動會立即停止。---細(xì)胞分裂停止在M期（同步化）。后期末期動物細(xì)胞胞質(zhì)分裂◆胞質(zhì)分裂(cytokinesis)開始于細(xì)胞分裂后期，在赤道板周圍細(xì)胞表面下陷，形成環(huán)形縊縮，稱為分裂溝(furrow)。分裂溝的位置與紡錘體極性微管和

鈣離子濃度升高的變化有關(guān)。 ◆胞質(zhì)分裂開始時，大量肌動蛋白和肌球蛋白在中間體處組裝成微絲并相互組成微絲束，環(huán)繞細(xì)胞，稱為收縮環(huán)（contractilering)。收縮環(huán)收縮、收縮環(huán) 處細(xì)胞膜融合并形成兩個子細(xì)胞。與有絲分裂有關(guān)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中心體(centrosome)：在G1期末開始復(fù)制，在S期形成1對，但二者不分開，到G2期一對中心體開始分離，各自向細(xì)胞兩極移動，最后每個子細(xì)胞各獲得1個中心體。動粒與著絲粒(centromere)：動粒是蛋白復(fù)合物，其分子構(gòu)成包括CENP-A,CENP-B,CENP-C,CENP-E等。其中CENP-A是一種組蛋白H3類的蛋白質(zhì)，位于動粒的內(nèi)層；人類著絲粒DNA由特殊的序列重復(fù)排列構(gòu)成，長幾千個kb，深入動粒內(nèi)層，成為內(nèi)層組成部分.Caffeine可使動粒與染色體脫離。紡錘體：微管分為3種，即星微管，動粒微管和極微管。中心體的分離需要2種馬達(dá)蛋白，即驅(qū)動蛋白相關(guān)蛋白（Kinesin-relatedproteins,KRPs，向微管負(fù)極運(yùn)動)和細(xì)胞質(zhì)動力蛋白（dynein,向微管正極運(yùn)動)。二、減數(shù)分裂(Meiosis)●減數(shù)分裂概念與過程：●減數(shù)分裂的意義●減數(shù)分裂特點(diǎn)減數(shù)分裂概念與過程◆概念：減數(shù)分裂是細(xì)胞僅進(jìn)行一次DNA復(fù)制，隨后進(jìn)行兩次分裂，染色體數(shù)目減半的一種特殊的有絲分裂

分為前減數(shù)分裂間期和減數(shù)分裂期。減數(shù)分裂前S期與有絲分裂前S期長度比較前減數(shù)分裂間期S期持續(xù)時間長減數(shù)分裂過程減數(shù)分裂Ⅰ前期Ⅰ

，前中期Ⅰ，中期Ⅰ，后期Ⅰ，末期Ⅰ和胞質(zhì)分裂Ⅰ減數(shù)分裂Ⅱ前期Ⅱ，中期Ⅱ，后期Ⅱ，末期Ⅱ，和胞質(zhì)分裂Ⅱ減數(shù)分裂過程Visibleevidenceofcrossingover聯(lián)會同源染色體配對排列在中期板上減數(shù)分裂特點(diǎn)◆遺傳物質(zhì)只復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次，導(dǎo)致染色體數(shù)目減半◆S期持續(xù)時間較長◆同源染色體在減數(shù)分裂期I(MeiosisI)配對聯(lián)會、基因重組，形成聯(lián)會復(fù)合體，同源染色體間遺傳物質(zhì)重組,產(chǎn)生新的基因組合。◆減數(shù)分裂同源染色體配對排列在中期板上,第一次分裂時,同源染色體分開。減數(shù)分裂的意義◆獲得父母雙方的遺傳物質(zhì)，確保世代間遺傳的穩(wěn)定性。 ◆增加變異機(jī)會，確保生物的多樣性，增強(qiáng)生物適應(yīng)環(huán)境變化的能力。◆減數(shù)分裂是生物有性生殖的基礎(chǔ)，是生物遺傳、生物進(jìn)化和生物多樣性的重要基礎(chǔ)保證。第三節(jié)細(xì)胞周期的調(diào)控(Cell-CycleControl)

細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期的調(diào)控細(xì)胞周期的檢驗點(diǎn)（checkpoint）MPF(Maturation-promotingfactor，

Mitosis-promotingfactor)的發(fā)現(xiàn)及其生化實(shí)質(zhì)

1971年，Masui和Markert在用非洲爪蟾卵子的實(shí)驗中提出MPF的概念。1988年Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=cdc2(CDK1)+clyclinB◆MPF是一種使多種底物蛋白磷酸化的蛋白激酶；由M期Cyclin-Cdk(Cyclin-dependentproteinkinase)

形成的復(fù)合物。MPF=CDK1/p34/cdc2+cyclinBHartwell

1960s,Nurse1970s

分別以芽殖酵母和裂殖酵母為材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncycle,cdc)。如：裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂；cdc2和cdc28都編碼34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行。酵母中發(fā)現(xiàn)的cdc(celldivisioncycle)T.Hunt1980s發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為cyclinA和B，在細(xì)胞間期內(nèi)積累，在細(xì)胞分裂期消失。周期蛋白廣泛存在于從酵母到人類的各種真核生物中。海膽中發(fā)現(xiàn)的周期蛋白（cyclin)細(xì)胞周期蛋白cyclin特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中蛋白含量呈周期性變化。含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框（cyclinbox），介導(dǎo)與CDK結(jié)合。有特異性：不同的cyclin結(jié)合并激活不同的CDK。M期周期蛋白有破壞框（destructionbox)，位于蛋白質(zhì)進(jìn)N末端，參與由泛素介導(dǎo)的蛋白降解。分為4類：G1型（cycD)、G1/S型（cycE)、S型（cycA)、M型（cycB)。作用：激活和引導(dǎo)不同的CDK作用于不同底物細(xì)胞周期蛋白cyclin細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶

cyclin-dependentkinase,CDKcdc2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故稱為CDK。Cdc2是第1個發(fā)現(xiàn)的CDK，又稱CDK1，可將特定蛋白磷酸化，如：將核纖肽磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10余種CDK，在CDK激酶結(jié)構(gòu)域中均含PSTAIRE保守序列，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。Cyclin與CDK的結(jié)合是CDK激活的必要條件，不是充分條件。CDK1蛋白在細(xì)胞周期中含量相對穩(wěn)定，而cyclinB的含量呈周期性變化。Cyclin-Cdk復(fù)合物的多樣性 G1S G2/MCyclin-CdkCyclin-CdkCyclin-CdkBuddingYeastCLN1,2,3-CDC28CLB5,(3,4)-CDC28CLB1,2(3,4)-CDC28FissionYeastCIG1-CDC2CIG2-CDC2CIG13-CDC2HigherEukaryotesCyclinD1,2,3-CDK4/6CyclinA-CDK2CyclinB-CDK1/CDC2CyclinE1,2-CDK2G1SubstratesSSubstratesG2/MSubstratesGrowthandMorphogenesisDNAReplicationMitosisCDK抑制因子

（CDKinhibitors,CDKIs)CDKI對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為2大家族：①INK4家族:包括p16,p18,p19等。p16抑制cdk4和cdk6。②Cip/Kip家族：包括p21Cip/WAF1，p27Kip1和p57Kip2等。其中p21Cip/WAF1抑制G1期CDK，如CDK2、3、4、6；還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen)結(jié)合，直接抑制DNA的合成。cyclinB的含量呈周期性變化周期性表達(dá)和降解·APC介導(dǎo)的靶蛋白（如M期周期蛋白）通過泛素依賴性途徑降解

后期促進(jìn)復(fù)合物：APC（anaphase-promotingcomplex)，由至少15種成分組成，即APC1-APC15。在體外促進(jìn)周期蛋白A、B降解，表明分裂中期向后期轉(zhuǎn)化也受到精密調(diào)控。CyclinA和B通過泛素化途徑（ubiquitinationpathway)降解(M期周期蛋白的破壞框起調(diào)節(jié)作用）泛素與泛素激活酶E1結(jié)合形成E1-泛素復(fù)合體。E1-泛素復(fù)合體將泛素轉(zhuǎn)移給泛素結(jié)合酶E2，形成E2-泛素復(fù)合體。在泛素蛋白連接酶E3的催化下，泛素分子連接到靶蛋白上。形成多聚泛素鏈。泛素化的靶蛋白被蛋白質(zhì)列解體（proteasome)逐步降解。G1期周期蛋白的降解G1期周期蛋白包括cyclinD和cyclinE。G1期周期蛋白不含破壞框，但含PEST序列。PEST序列促進(jìn)G1期周期蛋白通過泛素化途徑降解。

參與G1期周期蛋白泛素化的E2和E3與泛素化M期周期蛋白的E2、E3不同。二、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控CDK激酶是細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的引擎分子，對細(xì)胞周期起核心性調(diào)控作用。（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1激酶的作用CyclinB蛋白含量在G2期達(dá)到最大值，CDK1活性開始出現(xiàn)，磷酸化下游蛋白質(zhì)。CDK1的激活還需要Wee1/Mik1和CAK催化的CDK1的Thr14,Tyr15和Thr161的磷酸化，及Cdc25催化的Thr14,Tyr15的去磷酸化，才能表現(xiàn)出激酶的活性。（二）M期周期蛋白與分裂中期向分裂后期的轉(zhuǎn)化分裂中期后，cyclinA和cyclinB通過APC介導(dǎo)的泛素化途徑迅速降解，