土壤中微生物的分離微生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)從混雜的微生物群體中分離純化微生物的方法，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。

2.學(xué)習(xí)從菌落及培養(yǎng)特征初步辨識(shí)細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌四大類(lèi)微生物。二、實(shí)驗(yàn)原理

在自然界里，微生物的種類(lèi)繁多，數(shù)量很大，幾乎都是雜居在一起的。微生物群落在土壤的物質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有多種重要作用，它與土壤肥力和植物營(yíng)養(yǎng)有密切關(guān)系，同時(shí)又是工業(yè)和醫(yī)藥用菌的資源。從含有多種微生物的自然材料中，通過(guò)稀釋分離、劃線分離、單細(xì)胞分離等方法，使它由單個(gè)的個(gè)體在固體培養(yǎng)基上繁殖形成單個(gè)菌落，由于此菌落是由單個(gè)個(gè)體繁殖而來(lái)的，故可獲得純種。這種獲得單個(gè)菌株純培養(yǎng)的過(guò)程稱(chēng)為微生物的分離與純化。

2.平板分離法該方法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用普遍。其基本原理及特點(diǎn)包括兩方面：（1）通過(guò)稀釋涂布或平板劃線等技術(shù)能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞來(lái)源的純培養(yǎng)。

（2）通過(guò)控制培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)選擇性分離。選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、溫度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。三、實(shí)驗(yàn)用品(一)材料土壤樣品、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基。(二)器材無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌吸管、無(wú)菌水、酒精燈、接種環(huán)、接種針、火柴等。

四、實(shí)驗(yàn)操作1.連續(xù)稀釋分離法（1）稀釋土樣

稱(chēng)10g土樣，加到有90mL無(wú)菌水和少許玻璃珠的三角燒瓶?jī)?nèi)，充分振蕩，使土樣與水充分混合，使微生物充分釋放到土壤懸液(原液)中。用無(wú)菌吸管吸取土壤懸液lmL，加到一個(gè)盛有9mL無(wú)菌水的試管內(nèi)，制成稀釋度為10-1的土壤懸液，將此吸管在試管內(nèi)反復(fù)吹洗3次，然后取出，通過(guò)火焰，再插入紙?zhí)變?nèi)，以備再用。輕輕搖動(dòng)試管，使菌液均勻。再用剛才用過(guò)的吸管，插入試管內(nèi)，反復(fù)吹洗3次，然后取出lmL菌液，加到另一支9mL無(wú)菌水中，制成稀釋度為10-2的土壤懸液。相同操作直到獲得lO-4的土壤稀釋液。

（2）接種從稀釋液（10-4）各吸取1mL分別加到2個(gè)牛肉膏培養(yǎng)皿，從稀釋液（10-3）吸取1mL分別加到高氏一號(hào)、馬鈴薯、豆芽汁培養(yǎng)皿各2個(gè)。（3）倒平板

將培養(yǎng)基加熱融化，待冷至55～60℃時(shí)，右手持三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕輕地拔出，瓶口保持對(duì)著火焰；然后用右手手掌邊緣或小指與無(wú)名指夾住瓶塞，左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基與菌液混合并均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，靜置凝固。

倒如下平板：牛肉膏蛋白胨平板（分離細(xì)菌）2個(gè)：

加稀釋度為10-4的菌液；(2)高氏一號(hào)平板（分離放線菌）2個(gè)：

加稀釋度為10-3的菌液；(3)馬鈴薯培養(yǎng)基平板（分離霉菌）2個(gè)：

加稀釋度為10-3的菌液；(4)豆芽汁培養(yǎng)基平板（分離酵母菌）2個(gè)：

加稀釋度為10-3的菌液；(5)牛肉膏蛋白胨空白平板2個(gè)：

備用（細(xì)菌的劃線分離操作）分段劃線連續(xù)劃線恒溫培養(yǎng)

將分離細(xì)菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿置于（倒置）370C恒溫箱中，培養(yǎng)24小時(shí)；分離的放線菌（高氏I號(hào)培養(yǎng)基）培養(yǎng)皿置于（倒置）280C恒溫箱中培養(yǎng)7天；分離的霉菌（馬鈴薯培養(yǎng)基）培養(yǎng)皿置于（倒置）280C恒溫箱中培養(yǎng)4天；分離的酵母菌（豆芽汁培養(yǎng)基）的培養(yǎng)皿置于（倒置）280C恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)。

土壤微生物數(shù)量推算

土壤中的微生物經(jīng)稀釋傾注培養(yǎng)后，每一個(gè)活菌細(xì)胞可以在平板上繁殖形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的菌落，故可根據(jù)平板上菌落的數(shù)目推算出每克土壤中所含的活菌總數(shù)，計(jì)算公式如下：

每克土壤微生物的數(shù)量=

本次實(shí)驗(yàn)只計(jì)牛肉膏蛋白胨平板上的細(xì)菌數(shù)、高氏一號(hào)上的放線菌數(shù)。平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×(10/1)×100土壤克數(shù)菌落形態(tài)

多種酵母菌菌落細(xì)菌菌落(E.coli)菌落形態(tài)

放線菌菌落（諾氏鏈霉菌）放線菌菌落(鏈霉菌)Streptomycescoelicolor(天藍(lán)色鏈霉菌分泌抗菌素)Thompsonetal.

GenomeBiology2002一些土壤放線菌菌落菌落形態(tài)

多種細(xì)菌菌落菌落形態(tài)的描述舉例

1．圓形，邊緣整齊，表面光滑2．圓形，邊緣整齊，表面有同心圓3．圓形，葉狀邊緣，表面有放射狀皺褶4．圓形，鋸齒狀邊緣，表面較不光滑5．不規(guī)則形，波浪狀邊緣，表面有不規(guī)則皺紋6．圓形，邊緣殘缺不全，表面呈顆粒狀7．毛狀8．根狀菌落形態(tài)的描述舉例

微生物菌落隆起程度的差異綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa植物乳桿菌LactobacillusplantarumAnunkownisolate四大類(lèi)微生物菌落形態(tài)的比較

細(xì)菌放線菌霉菌酵母菌相對(duì)大小小較小大較小隆起隆起較扁平隆起隆起度較細(xì)菌為高光澤多潤(rùn)澤，或干燥無(wú)光澤，有皺摺，表面粉狀或顆粒狀無(wú)光澤