酵母RNA的分離、組分鑒定及含量測定編輯ppt1、掌握稀堿法分離酵母RNA的原理與操作過程。2、了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。3、學習紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法。[實驗目的]編輯ppt為何選用酵母為材料提取RNA?酵母核酸中主要是RNA(2.67-10.0%），DNA含量很少，且菌體易收集，RNA易分離。從酵母中提取RNA常用方法稀堿法:利用稀堿使細胞壁溶解,時間短，但RNA易分解。濃鹽法:加熱條件下，利用高濃度鹽改變細胞膜的通透性，使RNA釋放出來，產品色澤較好。本實驗用0.2%NaOH使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白質和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA。1.核酸分離[原理]編輯ppt酶促水解化學水解:

酸水解:堿基、核糖/脫氧核糖和磷酸

堿水解:RNA存在2′-OH，磷酸二酯鍵不穩定，得單核苷酸核酸水解方法2.組分鑒定RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶堿和磷酸組成，提取得的RNA中加10%硫酸煮沸即可得到這些組分的混合溶液（$），分別進行定性鑒定，以證明提取物是否為核酸。[原理]編輯ppt磷酸與鉬酸銨試劑作用產生黃色的磷鉬酸銨沉淀(1mL$+1mL定磷試劑)：

(NH4)2MoO4+H3PO4→(NH4)3PO4·12MoO3↓(黃色)Mo6+

SnCL2Mo4+Mo(MoO4)2(蘭色)編輯ppt嘌呤堿與硝酸銀作用產生白色的嘌呤銀化合物(1mL$+過量氨水+1mL0.1M的AgNO3)。②核糖與地衣酚(orcin)試劑反應呈鮮綠色(1mL$+1mLFeCl3+2mLorcin→水浴加熱)編輯ppt3.RNA含量測定核酸（DNA和RNA）堿基的苯環結構在紫外區有較強吸收，吸收高峰在260nm波長處，蛋白質則在280nm波長處。當OD260＝1時，dsDNA濃度約為50μg/mlssDNA濃度約為37μg/mlRNA濃度約為40μg/ml純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質、酚等污染）純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時表明有蛋白質或酚污染,可以增加酚/氯仿抽提）編輯pptOD260/OD280的比值用于估計核酸的純度,OD260/OD230估計去鹽的程度。

對于RNA純制品，其OD260/OD280≈2.0，OD260/OD230應大于2。OD260/OD230<2說明去鹽不充分,可以再次沉淀和70%乙醇洗滌。濃度計算：DNA樣品的濃度（μg/μl）:OD260×稀釋倍數×50/1000RNA樣品的濃度（μg/μl）：OD260×稀釋倍數×40/1000編輯ppt1．提取稱取干酵母粉0.4g，放入試管中，加入0.2%NaOH3mL，然后放入沸水浴中提取15min。2．分離用自來水冷卻,滴加1-4滴醋酸，調pH至6.0（沉淀蛋白質），裝入離心管配平，3000r/min離心3min，（使提取液與菌體殘渣分離）。3．抽提收集上清液，加等體積的氯仿，震蕩混勻，3500r/min離心5min。4．沉淀RNA收集上清，平均分裝入兩支離心管中，各加2倍體積無水乙醇，邊加邊攪拌，配平，3500r/min離心5min，得到RNA沉淀。棄去上清液（棄凈），一支離心管加5mL蒸餾水回溶，以備濃度測定；另一支離心管加入5mL10%的H2SO4,然后轉入50mL三角瓶中，待用。[操作步驟]注意配平、對稱放置離心管編輯ppt編輯ppt編輯ppt①RNA的酸解將裝有待測RNA的三角瓶，在電爐上加熱，至溶液透明為止，得到RNA的水解液，期間不停晃動，以使受熱均勻。[注意]RNA加熱酸解時，一定注意觀察，本步很容易加熱過度，使透明溶液變成黑褐色，而導致實驗失敗。5.RNA的組分鑒定編輯ppt.檢驗項目嘌呤核糖磷酸水解液1mL1mL1mL試劑NH3·H2O2mLAgNO31mL苔黑-FeCl31mL定磷試劑1mLSnCl21-2滴反應條件不振動觀察現象沸水浴約10min振蕩混勻室溫放置現象白色絮狀沉淀鮮綠色蘭色②組分鑒定加蒸餾水將水解液稀釋至5mL，然后按下表檢驗項目所需的量分裝三支試管中，進行組分鑒定。編輯ppt待測樣品適當稀釋（如量取100μLRNA水溶液，加2900μL蒸餾水混勻），用紫外分光光度計分別測定其230nm、260nm和280nm的吸光度值。可根據自己的樣品濃度調整稀釋倍數。黑體－透射調零蒸餾水－透射調100％吸收調零.6.RNA含量測定注意保護石英比色皿，輕拿輕放！編輯ppt配平：含液離心管與外套鐵管在一起兩組配平（先選兩個外套鐵管重量接近）對稱放于離心機的鐵套中。設置：閉蓋，選離心機設置鍵（“亮點”在轉速和時間的選擇上：可通過三角符號移位，然后再增減），設置數都完成后再按確認鍵。啟動：使“亮點”回到測定位置，按啟動鍵。轉動期間蓋子打不開。若聲音很大異常。立即按停止鍵。離心機的使用編輯ppt通過實驗現象說明鑒定的結果，由結果進一步說明你的提取物是什么？計算RNA溶液濃度及酵母RNA得率，并判斷樣品純度。將組分定性鑒