天然產物制備技術戴富寶第1頁/共49頁制備色譜所謂制備色譜是指待分離的樣品數量在g與g之間，分為分析型、半制備、制備型三種。第2頁/共49頁制備色譜對于制備型高壓液相色譜分類方法有不同觀點：例如對于高壓液相色譜snyder和kirkland（1979）根據色譜柱能分離樣品的量將其分為分析型（多孔型吸附劑，1～2mg，15min可分開兩個分辨率Rs＝1.25的化合物，回收純度>99%）,半制備型（100～200mg）和制備型（0.5～1.0g）三種。還可增加生產型色譜，即指那些樣品量在幾百克到幾千克之間的分離。Herbert（1991）限定制備型色譜為樣品量在克數量級，柱直徑在25～150mm之間的分離，而生產型色譜為所用柱直徑大于150mm的分離。所以對制備型一詞范圍，分離樣品量之間存在顯著的差別。第3頁/共49頁制備色譜選擇制備型分離系統時，不僅僅要考慮待分離樣品的量，還應考慮擬進行的分離的種類。充分考慮上述因素并正確選擇色譜柱、尺寸、固定相種類以及流動相流速等參數才能保證分離和制備的成功。根據以往工作經驗，往往采用兩個步驟來完成分離工作，選用低分辨率、快速分析柱進行粗分（其中可除去色素、鞣質等雜質）再用HPLC高分辨率色譜柱進行細分。第4頁/共49頁一、基本原理液相色譜的效能取決于分離速度和分辨率，對于制備型加壓液相色譜而言，上樣量是一個重要指標。分辨率速度載樣量第5頁/共49頁基本原理對于某個分離參數進行優化，往往會影響其它分離參數，例如：增加洗脫液流速會降低分辨率（Rs），分辨率會因上樣量過大而下降，上樣量過大的原因包括樣品溶液的體積過大或濃度過大，色譜柱的載樣量又取決于柱的直徑、長度、固定相顆粒大小以及裝填的緊密程度。對于偶爾的一次分離而言，其主要的目的是得到一定量的某個化合物，達到一定純度和回收率。而對于生產規模的色譜分離而言，單位時間內可分離的樣品量是一個關鍵指標，單位時間獲得樣品量即產量，取決于色譜柱直徑和洗脫液流速等參數，生產能力和樣品純度是兩個相互矛盾的因素，也就是說分辨能力并不是制備液相色譜考慮的首要因素。制備液相色譜應首先具有經濟快速地生產所需產品的能力。第6頁/共49頁加壓液相色譜中可發揮下列兩方面的作用（a和b）或其中之一：a、加快洗脫液流速，提高分離速度，因為敏感化合物在長時間色譜分離時，其結構可能會發生變化，縮短分析時間最大優點在于避免這種變化。b、允許在分離過程中使用顆粒度更小的固定相，獲得更高分辨率。微克級至毫克級樣品一般用于波譜測試確定結構毫克級樣品可用于進一步的結構鑒定，化學反應和某些生物活性測試，克數量級樣品可用于進一步生物活性測試、藥理、毒理實驗，作為合成或半合成工作原料及標準品。此外，所介紹的制備液相色譜技術也可用于分離超純標準品，標記化合物，痕量雜質，藥物分解產物及代謝產物，還可用于生物高分子（蛋白質、多糖等）及多肽類化合物的分離。第7頁/共49頁二、分離方法的建立和優化第8頁/共49頁為選擇制備型加壓液相色譜的分離條件可采用下列操作步驟：選擇液相色譜系統。在某些情況下，可以薄層色譜分析來初步確定分離條件（Heyward和munro,1980），即用硅膠薄層來確定正相柱條件，用反相硅膠薄層來確定反相柱條件。當選擇該方法時，要牢記薄層色譜中硅膠的表面積是柱色譜中硅膠表面積的兩倍，所選的展開劑條件應使樣品Rf值不大于0.3少量樣品在分析型液相色譜柱上的分離。在找到適當的薄層色譜分離的展開條件后，應將該條件轉用于分析型液相色譜。利用這種初步的分析來獲得正確分離條件的方法可以節省時間、樣品和溶劑。第9頁/共49頁操作步驟優化分析型液相色譜條件，應尋求較小容量因子（K’），其理由在于分析型液相色譜洗脫劑系統轉換為制備型液相色譜系統時，經常導致分離效能（分離度）下降。小的容量因子意味著分離時間縮短和出峰體積縮小。良好的分析型液相色譜分離通常是成功進行制備型液相色譜分離的先決條件。在找到分析型液相色譜分離條件后，通常將分離度調至高于分析型色譜所需水平。這樣可以與制備型色譜分離過程中的過載相適應（圖5.3）。在進行反相液相色譜分離時，增加溶劑系統中水的含量可達到這一目的。第10頁/共49頁操作步驟第11頁/共49頁操作步驟轉換至制備液相色譜系統。（Gareil1982b；Cox1988）將分析型液相色譜條件直接用于制備型液相色譜分離時，所用壓力應為分析型色譜的三分之一左右（Johnson1978）。Bidlingmeyer（1987）詳細介紹了經過薄層色譜→分析型高壓液相色譜→制備型高壓液相色譜，來選擇分離條件的方法。近期出現一種趨勢，將分析型大小填料直接用于制備型液相色譜柱，這將無需對流動相作較大的改變。Waters公司生產的Symmetry系列柱（內裝100ā）球形填料，即是這種色譜柱的代表。第12頁/共49頁操作步驟純化物質的回收。所得物質的分析，可以薄層色譜或分析型高壓液相色譜進分離物質進行純度和定性分析。分離結束后，可采用如下程序洗脫色譜柱（Simpson,1982）。正相柱：丙酮→水→甲醇→丙酮→四氫呋喃→二氯甲烷。反相柱：甲醇：四氫呋喃（1：1）或用純甲醇沖。第13頁/共49頁三、色譜柱制備型加壓液相色譜系統的關鍵部件是色譜柱。所選用色譜柱大小應取決于待分離樣品的量（Hupe1981；Verzele1988）。幾種經典色譜柱的直徑和上樣量的關系列于表5.1中。第14頁/共49頁色譜柱色譜柱的其它一些參數對于分離的成功也至關重要（圖5.4）。影響分辨率Rs的主要參數是選擇性α和容量因子k’，增大α值（選擇性或相對保留時間）對分離的成功非常主要。第15頁/共49頁色譜柱增大柱的直徑意味著可以承載更多樣品、增加產量。增加色譜柱長度，意味著可以加入樣品量和分辨率增大。半制備色譜柱我們認為Bondepak10m（3.9x300mm）色譜柱效能較佳。當時天然藥化教研室做了七個研究生，得了好幾個大獎，立下了汗馬功勞。第16頁/共49頁四、固定相常用固定相可分為液－固（吸附），例如硅膠、氨基、二乙醇等液－液和C18,C8,C4鍵合相等，凝膠和離子交換，前者為排阻色譜，后者為陽離子、陰離子交換色譜（強酸、弱酸、強堿、弱堿等）另外還有NH2柱等。選擇固定相應注意以下幾點：顆粒大小及其孔徑色譜柱長度操作壓力第17頁/共49頁固定相第18頁/共49頁固定相恰當地綜合考慮上述因素，才能得到好的分離效果。增加色譜柱長度可提高分辨率，但需施加更大壓力，減少固定相顆粒，增加分離度，樣品載樣量但增加操作壓力。一般來說，球形顆粒優于不規則形狀顆粒。它具有較高機械強度，不易破碎，裝柱重現性好，可增加樣品在柱中的滲透性，峰對稱較好、壽命長等優點。但球形固定相價格較高。柱層析顆粒在40－63m較易于干法裝柱，載樣量大，價格適中，能進行有效分離，最適宜顆粒大約為15m左右，顆粒減小增加N,Rs，但裝柱時需更高壓力。HPLC系統中顆粒大小為10m，5m，3m，1.8m等，其分離度好，易于純化樣品，對眾多天然藥物樣品分離、純化和制備是一條較好途徑。第19頁/共49頁五、裝柱方法裝柱方法一般來說，顆粒度大，干法（頓擊法）裝柱（20－30m），小于此顆粒裝柱較困難，一般采用濕法裝柱（即勻漿裝柱）。勻漿裝柱需一個高壓裝置、勻漿罐、與填料比重相近溶劑（二氧六環、四氯化碳），其方法根據柱子內徑和長度算出裝填量，加入溶劑，超聲，使成均勻勻漿（近透明），將柱子上螺絲卸下（經清洗、烘干、干凈空柱），連到勻漿罐，然后將勻漿到入勻漿罐，擰緊灌蓋，連接氣動泵螺絲，一瞬間壓下勻漿（400公斤），勻漿中溶劑經柱子從柱下口濾網快速濾出，而填料均勻下沉至柱中，再補打一次高壓（400公斤），放置半小時直到打緊為止。柱裝好后，放入高效液相色譜儀測試柱效和分離度，柱子即制備完成。以上是裝分析柱方法，制備柱也可用同法裝柱。第20頁/共49頁六、加樣在將樣品加到制備柱之前，需考慮以下因素：樣品的制備方法；溶劑樣品的溶劑；樣品重量；樣品體積；上樣方法；色譜柱。第21頁/共49頁加樣通常應盡可能選用流動相來溶解樣品，樣品在流動相中要有良好的溶解度。如果樣品體積太大，分辨能力就會下降；另一方面，如果樣品過濃，則有可能在柱頂部形成沉淀，壓力飆升而停泵。為了每次能得到更多的樣品，還是應在小體積的流動相中溶解較多的樣品。將成功的分析型分離放大為制備型分離時，可能會遇到樣品的溶解度問題。對于一些在水中難溶的樣品，在進行反相HPLC分離時，就經常遇到上述問題。例如植物毛兜鈴根部的粗提物在甲醇－水系統中溶解度差，為從提取物中獲得馬兜鈴酸，在HPLC分離前，先將樣品溶于甲醇－四氫呋喃1:1的溶液中。第22頁/共49頁加樣量如何放大當分析規模的分離優化后，就要研究在分析柱上的上樣量，以確定某種填料的容量。因為大規模的分離應該與小規模的分離相同，所以樣品最大上樣量將取決于分析規模分離的復雜程度要決定待純化或分離的樣品含量是多少需要純化的樣品含量一旦確定后，可以用簡單的方程式求出純化所需色譜柱的大小第23頁/共49頁不同規格柱上樣品量應用求得的放大因子乘以分析型柱的上樣量，以預測大直徑柱的上樣量。表1列出了常用不同規格柱上樣品量的指南。第24頁/共49頁很多因素可影響制備柱的容量。下列一些影響因素需加以考慮：保留值大的物質容量高樣品混合物簡單容量高（例如商陸皂苷甲、乙、丙、丁……）梯度分離比等度分離時容量要高分離度要求越高，容量越低上樣體積會限制容量大小樣品的溶解度會限制容量大小選擇不同的樣品溶劑也會影響容量大小第25頁/共49頁以3.9×150mm色譜柱放大到19×150mm色譜柱的情況舉例：用放大因子可以預測大柱上（填充柱與分析柱內裝相同的填料）大約可負載24～142mg樣品，此范圍是根據分析柱（內徑3.9mm）負載量1～6mg由放大因子計算而來。第26頁/共49頁流量的選擇計算的流量用于制備柱時，可使流動相用在分析柱上有相同的線速度。但是合適的流量還取決于色譜柱的內徑大小。色譜系統還受柱長增加及填料更細引起反壓增加的制約。第27頁/共49頁梯度分離時間(GD)得到的梯度分離時間可以輸入制備泵，使制備分離在此時間內流經制備柱，柱的柱體積數與相應時間流經分析型柱的體積數相同。第28頁/共49頁上樣方法：用注射器進樣;靜止進樣（泵停）;六通閥進樣;主動閥進樣;輔助泵進樣;固體上樣。第29頁/共49頁上樣方法固體上樣是解決樣品低溶解度的一種方法，可將樣品的干粉與柱填料混和，加入分離柱前的前置柱中。對于難溶的樣品（5mg/ml以下，每份樣品需混入5～10份填料）Miller等（1989）曾報道用前置柱方法分離0.1～1g的樣品。第30頁/共49頁七、高效液相色譜制備色譜儀器1、高壓泵（略）2、檢測器絕大多數商品檢測器都用于分析型工作，它們存在易飽和的問題（負載量受到限制）并不適合制備型分離。一些專門為制備型分離而設計的帶有樣品槽的檢測器也有出售，如GowMAS公司出產的80－800LC-UV檢測器，其中洗脫液以薄膜形式流經石英槽（Leutert1984），使用此檢測器流速可達500ml/min。第31頁/共49頁高效液相色譜制備色譜儀器帶有0.05mm長度的樣品槽的紫外檢測器可承受高達200ml/min的洗脫液流速。這種流速適合中壓液相色譜分離。而我們研究半制備高效液相色譜流量一般在20－30ml之間，尤其是2－8ml之間最佳。目標化合物分離度高，分離純化樣品量也較高。例如商陸皂苷甲，收集了一個星期，得到400mg，除了作波譜分析外，還提供作藥理實驗。第32頁/共49頁高效液相色譜制備色譜儀器HPLC的檢測器種類不多，兩種最常用的技術——紫外和示差檢測器在使用上有其局限性。示差檢測器當然對無UV吸收物質能檢測，但對溫度很敏感，靈敏度低，對少量物質檢測不理想而且不能采用梯度洗脫方式。對于無紫外吸收的物質一種日益受到歡迎的檢測方法是蒸發光散射檢測器（ELSD）,可用于揮發性成分，并可在梯度洗脫條件下檢測。該檢測方法需要通過加熱的方法使溶劑揮發，因此需要安裝一分流裝置，對易分解的成分另外收集。也可用薄層色譜對高濃度的流出液各流分進行檢測。另外也可用質譜對各流分進行定性和定量檢測。第33頁/共49頁八、流動相的選擇1、流動相的選擇是分離目標化合物的關鍵。根據，只要選擇最佳配比流動相，增加就可大大增加混合物分離度，其Rs>1.25以上，有如下好處：分離得目標化合物純度高上柱樣品量大收集到純的目標化合物量多波譜鑒定一次成功第34頁/共49頁流動相的選擇2、選擇流動相分方法。例如反相C18柱，流動相如甲醇和水的比例可用0～90％梯度的方式來確定，找到最佳分離時的甲醇－水配比，然后用該比例溶劑洗脫進行樣品分離、收集。3、選擇洗脫溶劑純度要高，否則會帶來雜質，干擾分離純化。另外溶劑在末端透過率一定要高，一般來說，使用HPLC溶劑可達到上述要求，如使用分析純甲醇，在254nm后透過率還可以，>230nm時基線就會漂移。特別在梯度時更為嚴重。4、流動相中非揮發性添加劑（如離子對色譜、置換色譜）會在產物回收時引起麻煩。要采用揮發性緩沖液來改進分離效果，又易于將其除去。例如，Mierzwa等（1985）利用半制備型18烷基硅膠柱，以乙腈－0.01mol/L乙酸銨（PH4.0緩沖液）（40：60）為洗脫劑，分離得到大環內酯抗生素。第35頁/共49頁九、被分離色譜圖的收集方法1、邊緣切割和循環色譜分離當對兩個多多個相距很近的主要成分進行分離時，若色譜系統的選擇性不足以將該混合物分開，此時可采用循環色譜分離（Charton等1994，圖5.6）。第36頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法在確定最佳分析型分離條件后進行制備型色譜分離，通過切割相應色譜圖的前部和后部可獲得純的a和b成分。利用此法，對a和b成分的混合物（循環組分）重新進行分離，可進一步獲得純品。如果一次循環分離還不能將a和b完全分離，則可重新進行循環色譜分離。實際上，循環色譜分離與增加柱長度的效果類似。圖5.6中，看到循環組分分離色譜帶變寬是因泵內溶劑體積過大等柱外因素引起，應將其檢測在最低限度。循環色譜分離中最先被洗脫的峰不應與上次分離中最后出的峰重疊。第37頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法循環色譜分離需具備兩個基本裝置：－密閉進樣－交換柱循環前一種是將流經檢測器的色譜柱流出液通過多向閥連于泵的入口。后一種是連接兩根色譜柱，使洗脫液從第一根柱直接流入第二根柱。必要時，在收集到純的樣品前，通過閥門控制，可將由第二根色譜柱切割得到的樣品再加到第一根柱上。該方法的優點在于樣品只流經泵一次。第38頁/共49頁2、色譜柱的過載和中心切割為提高制備型分離能力，可使色譜柱超載（含量和濃度超載，非容積超載），由于分離不是在線性條件下進行，最佳的分離條件無法再從分析型數據來控制。在利用“中心切割”技術進行分離時，需避免主要色譜峰前后兩端微量組分的污染（圖5.7）。被分離色譜圖的收集方法第39頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法用這種方法進行分離，可能損失少量a，但a的產量卻可提高。在實際分離過程中，可逐漸加大上樣量直到達到適當的超載程度，并通過中心切割得到一個不受色譜峰前后雜質的污染的產物。為了達到最大承載目的，樣品應盡可能溶在比流動相溶解能力差的溶劑中。第40頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法FarmaKalidis和Murphy（1984）利用中心切割法，從大豆中分離異黃酮類成分染料本苷genistin和大豆苷deidzin。如圖5.8所示，通過切割超載上樣的色譜得到一富含a的成分，對其進行一次分離即可得到純化合物a。第41頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法3、柱切換柱切換一詞包括改變流動相方向的所有技術。利用這類技術可使一根色譜柱的洗脫液流入另一根色譜柱（Ramsterner1988）。該技術具有以下優點：分辨能力和選擇性得到提高樣品可在運轉中純化將第一根柱得到的部分純化的流分通過后續的柱色譜分離（包括循環色譜可得到100％純度的樣品）微量樣品可得到富集減少用于清洗色譜柱等所花的時間。第42頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法利用轉換閥可將第一根柱的流分注入第二根柱。在第二根柱進行分離時，可同時用溶劑清洗第一根柱（Ramsteiner1984），用該法進行超載分離時十分有用。因中心切割所得組分可立刻被投入第二根柱，使其得到進一步純化。Little和Stahel（1984）利用該方法從菊科植物甜葉菊葉子的水－甲醇提取物中直接分得甜味劑甜葉菊苷（Stevioside）第43頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法第44頁/共49頁被分離色譜圖的收集方法關于循環高壓液相色譜儀，日